HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的表达及意义*

李琪雁，马丽雅，张云凤，王轶英

(1.河南大学人民医院 河南省人民医院妇产科，郑州 450003;2.郑州大学人民医院 河南省人民医院妇产科，郑州 450003)

宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一，严重威胁着女性健康。据全球最新数据统计，宫颈癌的发病率和死亡率在女性癌症中居第四位，而在经济水平较低的国家，宫颈癌的发病率和死亡率仅次于乳腺癌，且近年来呈年轻化趋势[1]。目前高危型人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)持续感染-宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-宫颈癌的演变模型已基本成共识。根据宫颈病变的严重程度，CIN患者的病理诊断分为低级别上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高级别上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。临床上部分CIN患者可发生自然转归，而部分则进展为癌，一些癌患者短期即发生转移。相同病理诊断的宫颈病变存在不同的转归，因此单纯通过病理诊断并不足以评估宫颈疾病的严重程度及预后，探寻更为客观的分子标记物在宫颈癌的防治中具有重大意义。p16、Ki67是评估宫颈病变严重程度的2个经典分子标记物，被广泛应用于临床。胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA binding protein 3,IMP3)可以促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，在多种肿瘤包括宫颈癌中发现存在异常表达。高迁移率蛋白A2(High Mobility Group AT-Hook 2,HMGA2)是一种细胞周期调控蛋白，可以促进肿瘤的发生发展。文献报道，IMP3与HMGA2在人类肿瘤中存在共表达现象，且HMGA2在胚胎发生及致癌过程中受IMP3调节[2]。本研究通过免疫组化技术检测HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同级别CIN和宫颈癌中的表达情况，并将HMGA2、IMP与两个经典分子标记物p16、Ki67比较，探讨4种分子标记物之间以及其与宫颈癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年1月河南省人民医院病理科存档的146例宫颈组织蜡块，其中包括30例正常宫颈组织(normal cervical epithelium,NCE)，36例LSIL，38例HSIL和42例宫颈癌(cervical cancer,CC)。所有标本均经本院病理科医师再次核对。正常宫颈组织标本来自在本院行宫颈锥切术或因妇科良性肿瘤(子宫肌瘤、子宫腺肌症等)行全子宫切除术后病理证实为正常宫颈者。42例宫颈癌患者均在本院接受根治性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术±腹主动脉淋巴结清扫术治疗，患者资料完整，平均年龄(47.17±11.39)岁；FIGO分期：I期20例(47.62%)、II期12例(28.57%)、III期10例(23.81%)；分化程度：高分化10例(23.81%)、中分化19例(45.24%)、低分化13例(30.95%)；病理类型：鳞癌31例(73.81%)、腺癌11例(26.19%)；淋巴结转移：有转移者15例(35.71%)，无转移者27例(64.29%)；浸润深度≤1/2者15例(35.71%)，>1/2者27例(64.29%)；脉管浸润：有浸润者26例(61.90%)，无浸润者16例(38.10%)；神经浸润：有浸润者8例(19.05%)，无浸润者34例(80.95%)。

1.2 主要试剂 鼠抗人p16单克隆抗体、兔抗人IMP3单克隆抗体、DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司，兔抗人HMGA2多克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人Ki67单克隆抗体(MIB-1)购自DAKO公司。

1.3 方法 选取的宫颈组织蜡块切片4μm，置于60℃烤箱中烤片1h，免疫组化染色在罗氏Bench Mark XT全自动免疫组织化学染色机上进行。操作步骤严格按诊断优化程序执行，程序结束后常规进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在光学显微镜下观察。以已知阳性片作为阳性对照，使用磷酸盐平衡生理盐水(PBS)代替一抗作空白对照。

1.4 结果判定 HMGA2主要表达于细胞核，IMP3主要表达于细胞质，染色阳性以出现棕黄色或棕褐色颗粒为准。免疫组化评分按半定量积分法判定：(1)染色强度:无着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分;(2)阳性细胞百分比：0%～5%为0分，6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,75%～100%为4分。免疫组化评分为染色强度与阳性细胞百分比乘积：0分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+),5～8分为中阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。p16定位于细胞核和(或)细胞浆内，Ki67定位于细胞核，以染色出现棕黄色或棕褐颗粒判定为阳性细胞。阳性细胞表达率:0%～30%为阴性(-)，31%～50%为弱阳性(+)，51%～75%为中阳性(++)，≥76%为强阳性(+++)。

2 结 果

2.1 各分子标记物在不同级别宫颈病变中的表达 HMGA2在NCE、LSIL、HSIL、CC中的阳性表达率分别为30.00%(9/30)、41.67%(15/36)、63.16%(24/38)、80.95%(34/42)，差异有统计学意义(H=29.948，P=0.000)。IMP3在NCE、LSIL、HSIL、CC中的阳性表达率分别为0.00%(0/30)、2.86%(1/35)、5.56%(2/36)、78.57%(33/42)，差异有统计学意义(H=92.147，P=0.000)。p16在NCE、LSIL、HSIL、CC中的阳性表达率分别为10.00%(3/30)、63.89%(23/36)、86.84%(33/38)、97.62%(41/42)，差异有统计学意义(H=91.421，P=0.000)。Ki67在NCE、LSIL、HSIL、CC中的阳性表达率分别为20.00%(6/30)、55.56%(20/36)、94.74%(36/38)、100.00%(42/42)，差异有统计学意义(H=88.626，P=0.000)。见表1、图1。

图1 免疫组化法检测HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宫颈病变中的表达(×200)

表1 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同级别宫颈病变中的表达

2.2 不同级别宫颈病变中各分子标记物表达的两两比较 HMGA2、IMP3在NCE、LSIL、HSIL组中的阳性表达率均显著低于CC组(Z=4.876、3.860、2.426,6.205、6.499、6.375，P=0.000、0.000、0.015,0.000、0.000、0.000)，HMGA2在NCE组中的阳性表达率显著低于HSIL组(Z=3.031，P=0.002)。p16、Ki67阳性表达率在不同级别宫颈病变中两两比较的差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同宫颈病变中表达的两两比较(Z/P)

2.3 HMGA2、IMP3、p16、Ki67表达与宫颈癌临床病理特征的关系 HMGA2表达与宫颈癌患者FIGO分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、神经浸润有关(均P<0.05)；IMP3表达与宫颈癌患者FIGO分期、分化程度、病理类型、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、神经浸润相关(均P<0.05)；p16与宫颈癌患者年龄、FIGO分期、分化程度、病理类型、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、神经浸润、宫旁浸润、侵及颈体交界均无相关性(均P>0.05)；Ki67与宫旁浸润有关(P=0.029)。见表3。

表3 HMGA2、IMP3、p16、Ki67表达与宫颈癌临床病理特征的关系

2.4 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宫颈癌组织中表达的相关性 Spearman秩相关分析结果显示，在宫颈癌组织中，HMGA2和IMP3阳性表达呈正相关(r=0.589,P<0.001)，p16和Ki67阳性表达呈正相关(r=0.599,P<0.001)。见表4。

表4 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宫颈癌组织中表达的相关性

3 讨 论

宫颈癌的发生发展是多因素共同作用的结果，涉及多种基因蛋白水平的变化。临床上大部分CIN可发生自然转归，只有小部分CIN进展为宫颈癌，另有一些宫颈癌患者短期内即发生远处转移，预后极差。一方面,宫颈癌筛查和病理诊断都不能对宫颈病变未来演变做出预测；另一方面,分子标记物有助于可疑病例的协诊以及复发和转移的高风险预测[3]。对宫颈病变严重程度以及预后做到准确评估，可避免过度治疗，减轻患者心理及经济负担。因此，探究更为客观的分子标记物在宫颈病变中的表达情况，从而进一步研究宫颈癌潜在的发生发展机制，对提高宫颈癌的诊疗具有重大意义。

HMGA2是一种非组蛋白结构转录因子，其自身没有转录活性，但是其可与DNA序列中富含AT的小沟特异性结合改变染色体结构，从而影响细胞生长、分化、衰老、凋亡、DNA损伤修复等多种生物学过程[4]。HMGA2主要在胚胎发生过程中表达，而在高分化或成熟组织中基本检测不到。多项研究表明，HMGA2在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌和甲状腺癌等恶性肿瘤中存在异常表达，其过表达与高转移风险和不良预后有关[5]。本研究结果表明，随着宫颈病变严重程度逐渐加重，HMGA2阳性表达率逐渐上升。这与Wang等[6]报道相似。本研究中HMGA2表达与宫颈癌患者FIGO分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、神经浸润有关，提示HMGA2在一定程度上促进宫颈癌的浸润和转移，对宫颈癌患者的预后和生存评估具有重大意义。关于HMGA2促进宫颈癌发生发展的机制仍未完全确立。Wang等[7]通过动物体内外实验研究证明，HMGA2通过激活ATR/Chk1信号通路，促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和淋巴结转移。HPV整合是宫颈癌发生过程中的关键遗传事件，Hu等[8]通过对26例CIN、104例宫颈癌以及5个宫颈癌细胞系行全基因组测序和高通量病毒整合检测，发现HMGA2以7.8%的积分频率成为新的HPV整合热点，HMGA2蛋白表达升高与其侧翼区域的HPV整合有关，为HMGA2促进宫颈癌提供新的见解。

IMP3是mRNA结合蛋白家族成员之一，在神经发育、细胞迁移、代谢和癌细胞存活中起着重要作用[9]。和HMGA2相似，IMP3在胚胎组织及多种肿瘤组织中高表达，而在成人分化成熟组织中鲜有表达，与肿瘤的发生发展、不良预后密切相关。Lu等[10]研究发现，与CIN或无异常增生的宫颈组织相比，IMP3不仅在侵袭性鳞状细胞癌中的表达显著增加，而且在并发侵袭性鳞状细胞癌的CIN3病例中的一个亚组中表达显著增加，认为IMP3可作为CIN进展为宫颈癌的一个预测生物标记物。Wei等[11]研究证明，IMP3表达与宫颈鳞状细胞癌的生存不良有关。本研究结果表明，IMP3在正常宫颈组织、CIN组织中表达极少，而在宫颈癌中的表达明显升高[78.57%(33/42)]，且IMP3表达与宫颈癌患者FIGO分期、分化程度、病理类型、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、神经浸润有关，提示IMP3促进宫颈癌的发生发展，可作为不良预后和生存评估的分子标记物。Zhang等[12]研究发现，环状RNA circCDKN2B-AS1通过与IMP3蛋白相互作用来稳定有氧糖酵解，以稳定HK2 mRNA，从而促进宫颈癌细胞的恶性表型。

p16是一种细胞周期依赖激酶抑制因子，Ki67是一种核增殖标志基因。正常生理条件下，两个分子不会共表达，当出现共表达时提示由HR-HPV感染介导的细胞周期失调，并预测高级别宫颈上皮病变的存在[13]。在一项包括40509例研究对象的横断面研究中，p16/Ki67显示出很好的分流潜能及对CIN2患者HPV清除的预测能力[14]。本研究结果表明，p16和Ki67阳性表达率均随宫颈病变加重逐渐升高(均P<0.05)，而在LSIL与HSIL两组比较中，p16和Ki67的阳性表达率差异有统计学意义(均P<0.05)，提示p16和Ki67可能促进宫颈癌的发生，并且在LSIL与HSIL的鉴别诊断上具有一定的应用价值，与研究报道相符[15]。本研究中Ki67与宫旁浸润具有相关性，p16与各项宫颈癌临床病理特征均无显著相关。推测这可能是因为p16和Ki67在宫颈癌的辅助诊断中具有较高的敏感性而特异性较差。因此p16和Ki67不太适用于临床上宫颈癌患者的预后评估，但本结果还需要大样本临床数据支持。

本研究结果显示,宫颈癌中HMGA2和IMP3表达呈正相关。这与Jonson等[2]研究相符，该研究还指出，IMP3通过抵抗Ago2/let-7与HMGA2 mRNA之间的交点来保护和上调HMGA2。Sheen等[16]研究证实，IMP3可结合并增强高迁移率族HMGA2 mRNA的稳定性。本研究中p16和Ki67表达呈正相关，提示p16和Ki67在促进宫颈癌发生发展方面具有协同作用，但是两者是否具有潜在的相互作用调节机制有待进一步研究。

综上所述，HMGA2、IMP3、p16、Ki67阳性表达率均随着宫颈病变严重程度逐渐升高，提示这四种分子标记物可能在宫颈癌的发生中起重要作用。HMGA2和IMP3可能参与促进宫颈癌的浸润和转移，对宫颈癌患者的不良预后评估具有重要作用,两者之间可能存在某种调节机制，可作为宫颈癌靶向治疗的潜在靶点。p16和Ki67对临床上LSIL与HSIL的鉴别诊断具有重要意义。