三例成骨发育不全胎儿的基因变异分析和产前诊断

靳冰玉，王 陈，赵 悦，张晓康，梁 宾，向 阳，卢 丹，郑 芳

(武汉大学中南医院 a.基因诊断中心;b.超声影像科，武汉 430071)

成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)，又称“脆骨病”、“瓷娃娃病”，是一种具有临床异质性的罕见性骨骼遗传病，在新生儿中发病率为1/15000～1/20000[1]，其病变范围不仅限于骨骼，还常累及眼、耳、牙齿、皮肤等，临床主要特征为身材矮小、多发性骨折、蓝色巩膜、牙本质发育不全、进行性听力丧失等[2]。OI的发生大多数是由编码I型胶原α链的COL1A1、COL1A2基因突变引起，其中COL1A1基因突变最为常见，通常是常染色体显性遗传，此外其他基因如TMEM38B、FKBP10、CRTAP、SERPINF1、PPIB、PLOD2以及WNT等也被报道与常染色体隐性遗传成骨不全症密切相关[3-4]。OI患者从轻微骨骼畸形到严重甚至到死亡程度不一，超声是目前产前诊断OI的主要方法，超声结合基因检测将更有助于明确诊断OI和进行分型。本研究对3例胎儿组织DNA行全外显子组检测并对发现的突变进行Sanger测序验证，为遗传咨询和产前诊断提供有力的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2019年4月至2019年9月，3例就诊于武汉大学中南医院的孕妇产前超声提示胎儿成骨发育不全。胎儿1：孕25周，双顶径5.56cm，胎头周径20.36cm，胎儿腹围18.96cm，股骨长3.08cm，肱骨长3.16cm，产前超声提示胎儿颅骨形态异常，呈“橄榄”状，双下肢长骨短小、弯曲成角(图1A)，充分知情下引产结束妊娠并提取胎儿组织DNA行全外显子测序。胎儿2:孕23周，双顶径5.52cm，胎头周径19.82cm，胎儿腹围16.8cm，股骨长2.9cm，肱骨长3.01cm，产前超声可见胎儿双下肢短、弯曲(图1B)，孕24周时于我院引产，并将胎儿组织DNA进行全外显子测序。胎儿3：孕24周，双顶径5.94cm，胎头周径22.31cm，胎儿腹围19.64cm，股骨长3.01cm，肱骨长3.68cm，超声明显可见双下肢长骨短小，双侧股骨弯曲，右侧股骨弯曲成角(图1C)，B超提示成骨发育不全的可能性较大，故而引产并行全外显子测序基因检测。其母曾在2016年孕第一胎时超声检查胎儿双侧股骨弯曲，股径测量值小于正常值后引产。本研究经武汉大学中南医院医学伦理委员会批准，胎儿父母均签署知情同意书。

图1 3例胎儿产前超声股骨图片(箭头指示股骨)

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取胎儿引产组织并提取DNA，采集胎儿父母外周静脉血样各2mL,EDTA-K2抗凝，提取基因组DNA(Zymo Research Quick-DNA Miniprep Plus Kit,USA)，所有步骤均按DNA提取试剂盒说明书操作。

1.2.2 全外显子测序(WES)及数据分析 取胎儿及其父母的基因组DNA，委托上海韦翰斯生物医药科技有限公司，通过超声打断进行文库构建，利用Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6试剂盒进行富集，捕获的DNA进行固相桥式PCR，并在Illumina HiSeq2500上进行双端测序。测序数据首先去除原始数据中不符合质控要求的Reads，然后使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件与UCSC(https://genome.ucsc.edu/)提供的hg19版本人类基因组参考序列进行比对，最后使用基因组分析工具包3.7(GATK，Genome Analysis Toolkit)找出变异。进一步与人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和成骨不全症数据库(http://www.le.ac.uk/genetics/collagen/)比对，确定其是否为已知致病突变位点，用在线工具Mutation taster(http://www.mutationtaster.org/)预测突变位点的效应，可获得突变效应分数；用在线工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)对错义突变进行蛋白功能预测，预测分数越接近1，致病可能性越大；用ANTHEPROT 6.3软件对COL1A1和TMEM38B基因编码的野生和突变型蛋白质二级结构和疏水性比对分析，用UniProt(https://www.uniprot.org/)在线分析突变位点在不同物种中氨基酸的差异，以观察突变位点处氨基酸序列的保守性。

1.2.3 聚合酶链反应及Sanger测序验证 根据发现的可疑致病位点,使用Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)针对COL1A1基因c.2533G>A(p.Gly845Arg)、c.932G>A(p.Gly311Asp)以及TMEM38B基因c.286dupT(p.Cys96Leufs*3)位点分别设计引物，在PCR扩增仪上完成基因目标变异位点的扩增，PCR扩增反应体系为20μL，包括DNA模板2μL，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme biotech，P211)混合体系10μL(包含Taq Plus DNA Polymerase、dNTP以及缓冲体系)，上、下游引物混合液1μL，补充ddH2O至20μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次，72℃继续延伸5min，4℃保温。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果并将家系成员PCR产物用ABI 3730s型DNA序列自动分析仪(3730 DNA Analyzer)测序，与标准序列比对分析，以确定基因突变位点。

2 结 果

2.1 全外显子组测序(WES)及Sanger验证结果 胎儿1携带一个COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)杂合错义变异，Sanger测序验证父母均未携带该变异(图2A1-3)，在HGMD数据库中已报道该变异；胎儿2携带COL1A1基因c.932G>A(p.G311D)杂合错义变异,Sanger测序验证父母未携带该变异(图2B1-3)，该变异收录在HGMD数据库；胎儿3携带TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)纯合变异，Sanger测序验证父母均为该位点杂合变异(图2C1-3)，检索HGMD、EXAC、gnomAD数据库、千人基因组等多个数据库，均未收录该变异位点。

图2 Sanger法测序验证COL1A1、TMEM38B基因变异位点结果(箭头指示变异峰)

2.2 生物信息学分析结果 Mutation taster和PolyPhen-2在线工具预测COL1A1、TMEM38B基因变异位点均为有害，提示突变位点可对蛋白质的功能造成较大的损害，其中COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)、c.932G>A(p.G311D)杂合错义变异Mutation taster评分均为0.999，PolyPhen-2评分均为1，TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)纯合移码变异Mutation taster评分为1，经ANTHEPROT 6.93软件比对分析发现3个变异型蛋白质的二级结构和疏水性均发生改变(图3)，用Uniprot在线比对多个物种在变异位点处的氨基酸序列，发现3个变异位点处的氨基酸在物种进化中具有高度保守性。

图3 A、B、C分别是COL1A1 p.845、COL1A1 p.311、TMEM38B p.96野生型和变异型附近蛋白质二级结构以及疏水性示意图

2.3 致病性分析结果 胎儿1携带COL1A1基因c.2533G>A(p.Gly845Arg)杂合错义变异，按ACMG指南标准[5]，该变异为“致病性的”(PS1+PS3+PM2+PM6+PP3)，导致常染色体显性遗传成骨不全症。该突变与已确定为致病性的变异在同一位点有相同的氨基酸改变(PS1)[6]，且体外功能实验已明确该变异会导致基因功能受损(PS3)[7]。该变异为罕见变异，在千人基因组、EXAC、gnomAD数据库中均没有收录(PM2)，经一代测序验证胎儿1父母均未携带该变异(PM6)，Mutation taster、PolyPhen-2以及ANTHEPROT 6.93等多种软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害影响(PP3)。胎儿2携带COL1A1基因c.932G>A(p.Gly311Asp)杂合错义变异，该变异为可能致病性(PM1+PM2+PM6+PP3)，可导致常染色体显性遗传成骨不全症。该变异位于热点突变区域(PM1)，在千人基因组、esp6500和gnomAD数据库中均没有收录(PM2)。一代测序结果显示胎儿2父母均未携带该变异(PM6)，生物信息学分析工具预测该变异可损害蛋白质的功能(PP3)。而且胎儿1和胎儿2是新发突变，一般情况下表型比较严重。胎儿3携带TMEM38B基因c.286dupT(p.Cys96Leufs*3)纯合变异，该位点变异为致病性变异(PVS1+PM2+PM3)，导致常染色体隐性遗传成骨不全症。有文献报道在体外功能实验中该基因的无义突变可引起mRNA降解导致基因功能受损[2,8]，推测TMEM38B基因的功能丧失是OI的致病机制(PVS1)，该变异在EXAC、gnomAD及千人基因组等数据库中频率为0(PM2)且一代测序结果显示胎儿3父母均携带杂合变异(PM3)。

3 讨 论

OI是一种以骨质脆弱和易骨折为特征的遗传性结缔组织疾病，严重成骨不全胎儿难以存活，目前我国关于成骨不全症致病基因的研究仍缺乏且临床尚无治愈方法，故早期诊断、预防患儿出生尤为重要。Sillence等根据患者的临床特征和影像学资料将成骨不全症分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型，这是OI分型最经典的方式并一直使用至今。Ⅰ型症状表现较轻，常为轻微的骨质脆弱和蓝色巩膜，发生率高；Ⅱ型又称致死型，有严重的骨质减少，长骨常表现为弯曲、短小，较多见于胎儿期，可伴有宫内骨折；Ⅲ型是新生儿期存活下来最严重的类型，症状严重程度受年龄、其他并发症等多因素影响，常呈进行性加重；Ⅳ型严重程度介于Ⅰ至Ⅲ型之间[9-10]，后续随着越来越多的OI患者被学者们发现，新类型的OI也逐渐出现，目前OI类型至少已达18型(Ⅰ型至ⅩⅧ型)。

OI主要由I型胶原蛋白缺陷引起，I型胶原蛋白作为皮肤、肌腱和骨的细胞外基质的主要组成部分[11]，由两条α1链和一条α2链组成，具有三螺旋结构，胶原蛋白的正确折叠以及三重螺旋的稳定性对其功能发挥有重要作用，最常见的三肽单位是甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸，通常描述为G-X-Y，它对三螺旋结构的稳定性贡献最大[12-13]。COL1A1基因位于17q21.33，包含51个外显子，编码I型胶原蛋白两条α1链，COL1A1基因突变可使I型胶原的数量或结构异常，从而导致骨质脆弱促使OI的发生[13-14]。如COL1A1突变使I型胶原螺旋区域的甘氨酸被取代后延迟了螺旋折叠，延长了修饰酶的进入时间，三螺旋结构稳定性改变，影响胶原蛋白的功能发挥进而导致OI[1]。本研究中的另一种基因TMEM38B定位于9q31.2，包含6个外显子，编码具有291个氨基酸残基的跨膜蛋白钙离子通道蛋白B(TRIC-B)，TRIC-B在大多数哺乳动物组织的内质网中表达，参与胞内钙离子的释放[15]。参与胶原代谢的多个蛋白具有钙依赖性，TRIC-B缺乏可通过破坏内质网内的钙依赖性基因表达以及蛋白与蛋白之间相互作用从而影响胶原合成或者通过抑制骨矿化的有效性而导致OI[11，16]。2012年首次报道TMEM38B基因是一个新的OI致病基因，可导致OI XIV型[8]，目前在国内外已被报道的TMEM38B基因突变导致OI的病例中，均为常染色体隐性遗传。然而这些突变导致的临床结果是复杂的，仅根据突变的位置和类型难以预测OI严重程度[17]。

本研究发现，胎儿1的COL1A1基因中错义变异c.2533G>A(p.G845R)导致第845位密码子编码的甘氨酸被精氨酸替代。1988年Byers等[18]首次报道在成骨不全症II型患者中发现该变异，有研究在1例致死性围产期OI患者中发现该突变[7]。胎儿2COL1A1基因中发现的1个杂合错义变异c.932G>A(p.G311D)，使COL1A1基因的第311位密码子编码的氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸。以上两个突变所在结构域是G-X-Y重复序列的胶原蛋白发挥生物学功能的关键结构域，G-X-Y三联体中甘氨酸的错义变异可破坏蛋白结构和降低蛋白分泌水平而促使OI发生。有研究表明，I型胶原蛋白α1链不同残基被替换导致OI严重程度不同，当带电荷的氨基酸如天冬氨酸和精氨酸取代甘氨酸时更容易产生致死性后果[19]。胎儿3TMEM38B基因中发现一个纯合移码插入变异c.286dupT(p.C96Lfs*3)，第96位密码子编码的半胱氨酸变为亮氨酸，随后移码了两个氨基酸产生了一个终止密码子，缺少了193个氨基酸，导致TRIC-B蛋白被截断，蛋白降解致含量不足，胶原蛋白结构改变以及合成受损从而造成功能异常，影响正常的骨骼发育，目前尚无文献报道该变异。前面两个新发突变，再发风险一般认为是1/100，但不能排除生殖腺嵌合的可能。后面这个常染色体隐性遗传的再发风险是1/4。三个家系都要进行遗传咨询和产前诊断，妊娠时可行介入性产前诊断进行基因检测或变异位点的验证，避免患儿的出生。

综上所述，本研究发现了COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)、c.932G>A(p.G311D)杂合变异以及TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)纯合变异。其中，TMEM38B基因变异是新发现的致病变异位点，研究结果丰富了成骨不全症基因变异图谱，并为家系的产前诊断和遗传咨询提供了重要依据。