韩江流域大刺鳅人工繁殖技术及染色体核型分析研究

孙延杰，李旭杰，查广才，林标涛，朱藴丹，杨东娟★

（1.韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041；2.广东省潮州市农业科技发展中心，广东 潮州 521041）

大刺鳅（Mastacembelus armatus）在分类上隶属于鲈形目（Perciformes）、刺鳅科（Mastacembeli⁃dae）、刺鳅属（Mastacembelu），在我国南部及西南部的各水系均有分布，广东、广西等区野生资源较多；但近年来的滥捕及江河环境污染，使大刺鳅野生资源受到了严重的破坏，大刺鳅已成为广东等地重点保护的野生水生动物之一［1-4］.大刺鳅肉质鲜美，高蛋白、低脂肪，符合人们对高品质膳食的营养需求［5-6］.市场对大刺鳅需求不断增长，加快其人工繁育技术研究，促进其种质资源保护和利用迫在眉睫，突破大刺鳅的人工繁育技术是开展其资源保护和开发利用的基础［7］.目前，国外对大刺鳅的研究主要是对大刺鳅精子冷冻保存研究［8］，检测重金属［9］和PCBs［10］在体内富集情况以及STC活性在性腺周期内雌雄间的差异［11］.国内目前关于大刺鳅生物学方面的研究较多，主要有食性、繁殖、营养、及亲缘地理等方面［12-16］，其中的人工繁殖研究主要在室外大池环境中进行.遗传特性相关的研究有大刺鳅线粒体DNA完整测序［17］和华南及邻近地区大刺鳅遗传多样性的ISSR分析［18］等.有关大刺鳅染色体核型分析研究尚未报道.

本研究意在进行试验装置和培养驯化条件优化，通过对亲鱼注射催产激素进行人工催产繁殖，分析大刺鳅产卵量、受精率、孵化率和幼苗存活率，以此探讨大刺鳅的人工繁育关键技术，探索经济实惠的大刺鳅人工繁育技术体系；同时，进行大刺鳅的核型分析，从细胞水平上了解其遗传特征，为大刺鳅优良品种选育建立基础.该研究对更好地保护和开发利用大刺鳅资源具有较大意义.

1 材料与方法

1.1 实验材料

大刺鳅均来自韩江流域，人工配制鳗鱼饲料，丰年虫卵，丰年成虫，漂白粉，多情素（宁波第二激素厂），复方促性腺激素释放激素类似物（宁波第二激素厂），PHA溶液（1 mg/mL），秋水仙素溶液（250 μg/mL），卡诺氏固定液等.

实验主要仪器为鱼缸（约35 cm × 20 cm × 15 cm），鱼网、筛子（80 目），体视显微镜（Nikon SMZ1000），显微镜（Olympus IX73），离心机（Gence TG16-W）等.

1.2 实验方法

1.2.1 人工繁殖体系设计

大刺鳅人工繁殖体系主要由催产缸、孵卵缸及种苗培育缸组成，水中放置几尾金鱼以指示水质与经消毒的PVC管，鱼缸用水为充分曝气的自来水，并保持24 h曝气及过滤.催产缸内配备潜水泵抽取原水，回冲入缸中形成微水流，以模拟野外水流环境，促进亲鱼发情产卵.孵卵缸、种苗培育缸套黑色塑料袋以避光，保持微流水条件.

1.2.2 亲鱼的选择与驯化培育

亲鱼的选择基本要求是体型正常、体质健壮、性成熟、体表完好，捕获的野生大刺鳅.亲鱼在模拟野外环境的条件下进行驯化培养，初期投喂鲜活小虾，每天递减投喂鲜活小虾量，适量增加冰鲜小虾量，直至均投喂冰鲜小虾，待大刺鳅均摄食冰鲜虾后，投喂动物性饵料混合实验室自制配合饲料，并逐渐增加人工配合饲料的比例，直到全部投喂人工饲料为止［19］.待亲鱼完成驯化和饵料转换之后，定时投喂自制配合饲料，根据每次摄食情况，调整投喂量.待亲鱼腹部有明显隆起，转入催产缸后，加大投饵量，同时注意催产缸水环境监测.

1.2.3 人工催产授精

人工催产注射药物为2 mL生理盐水＋2 mL多情素＋0.1 g复方促性腺激素释放激素类似物，剂量为0.5 mL/尾，背部肌肉注射，进针深度约1.5 cm 左右［20］.雄鱼的药物剂量为雌鱼的1/2.采用两针法，第一针为总剂量的1/5，第二针间隔24 h，注射剩余部分.催产缸水温24-27 ℃，预计效应时间为36 - 48 h，催产过程保持周围环境安静， 减少亲鱼应激反应［20-21］.

接近效应时间时，要加强对亲鱼的观察；当轻压雌鱼腹部有鱼卵流出，马上人工授精［22-25］.雄性大刺鳅人工取精采用人工挤压肚脐，精液流出使用注射器进行抽取，雌性大刺鳅人工挤卵到烧杯中，将抽取到的精子注射到收集到烧杯里的卵子，并轻轻搅拌均匀，完成人工授精.人工授精需全程在室内阴凉处进行，所用工具事先均需清洗消毒.

1.2.4 幼苗的孵化与培育

将人工授精后的受精卵分别均匀倾倒在经消毒的孵卵缸中的木麻黄针叶和榕树的气生根上，使受精卵粘附其上，避光孵化.受精卵呈明显透明色，未受精卵呈乳白色，需及时将未受精卵用吸管吸出，否则未受精卵极易被细菌感染，影响水质，同时对受精卵产生影响.刚孵化的鱼苗腹部有一膨大的卵黄囊，可维持自身营养达5 d.大刺鳅鱼苗破壳6-7 d后卵黄囊消失，此时以丰年虫幼体为开口饲料，蛋黄为辅助.饲料要均匀泼洒，原因在于鱼苗游动能力较弱，自主觅食能力不强［24-25］.大刺鳅鱼苗孵化后15 d开始用冷冻的丰年虫（需解冻）进行投喂.

1.2.5 水质处理与疾病预防控制

驯化阶段，每天定时清污换水，利用哈希HQ40d53检测水质（温度、pH值和溶解氧）.催产后，换水时往水中加入0.3 g/m3的二溴海因进行消毒.若有亲鱼受伤，则每天将亲鱼捞出浸泡在3%-5%氯化钠溶液5 min，再置于新的清水中.鱼苗孵化前，需用胶头滴管将水中未授精的卵子吸走；鱼苗孵化后，用虹吸管每天吸污两次，每天换水40 %，每天进行一次水质检测.

1.2.6 染色体的制备

采用植物血细胞凝集素（PHA）体内注射法，在人工催产后的亲鱼胸鳍基部注射PHA 溶液（1 mg/ mL），剂量为10 μg/g，24 h 后，胸鳍基部注射秋水仙素溶液（250 μg/mL），剂量为4 μg/g.4-5 h 后将鱼断尾及剪断鳃部动脉在水中放血30 min.取头肾组织，0.8%生理盐水清洗3 次，剪碎，加入少量0.8%生理盐水，弃去未解离的肾组织，制成细胞悬液.1 000 r/min 离心5 min，收集细胞，加入预热的0.075 mol/L的kcl，于37 ℃低渗40 min，1000 r/min离心5 min，弃上清.卡诺氏固定液固定30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复固定一次，弃上清，留下0.2-0.5 mL的固定液，吸管轻吹打使其成为细胞悬液；吸取细胞悬液滴于预冷的载玻片上，吹散，晾干；干燥后的滴片置于装有Giemsa染液的染色缸内，染色20-30 min，自然干燥，显微镜观察并拍照.

1.2.7 染色体数目及核型分析

选取染色体分散良好、着丝点清晰的细胞用显微镜观察、照相.观察统计50 个完整的中期分裂相，确定染色体数目与体细胞染色体倍数.

选择状态良好的5个细胞中期分裂相，精确测量染色体的长度，用于核型分析.标本经拍照放大后粗略测量照片上每条染色体长度，根据长短初步按顺序编号，标记在染色体短臂的一侧，同时确定主缢痕所在的位置，用游标卡尺测量每条染色体的长臂、短臂长度.

根据测量的染色体参数数据，计算出染色体的相对长度，臂比及着丝粒指数.根据测量结果，将染色体由长到短同源染色体重新编号，从左到右依次排列在纸上.着丝点位于同一水平线上，同时短臂在上，长臂在下.

核型模式图用Excel绘制，横坐标为染色体序号，纵坐标为染色体的相对长度.绘制染色体核型模式图时，短臂在上，长臂在下.

2 结果与分析

2.1 亲鱼的选择培育与人工催产

野生大刺鳅在驯养过程中部分死亡，存活且可完全进食人工饲料的雌鱼有19条，雄鱼28条.雌鱼体色呈淡黄色，腹部膨大且柔软，生殖孔呈圆形、微红，体重平均190 g；雄鱼体色呈灰黑色，体形较长，腹部不膨大且较硬，生殖孔尖小突出、体重平均220 g.

催产过程中，雄鱼24条催产后人工挤压有乳白色的精液流出，精液较浓；雌鱼在注射激素后第二天能产卵的有14条，在注射激素后第三天产卵的有5条，雌鱼催产率为100%，见表1.

表1 人工催产结果

2.2 人工授精与幼苗孵化

孵化介质为木麻黄针叶和榕树气生根，两介质均长18 cm，直径1 mm，每100根集成一束，用扎带捆绑一段，另一端散开，每缸放置2束.实验结果显示，木麻黄针叶介质组稍好于榕树气生根介质组，平均受精率分别是91.7 %和79.8 %（表2）；木麻黄针叶介质组孵化率显著高于榕树气生根介质组，平均孵化率分别是46.1%和1.7%.两组介质对受精率影响相当，但木麻黄针叶介质组更利于大刺鳅卵孵化；因此，选择合适的孵化介质有助于提高大刺鳅人工孵化率.

表2 人工授精结果表

以木麻黄针叶为孵化介质的大刺鳅受精卵发育较好，孵化率为46.1%（表3）.

表3 人工孵化结果表

2.3 幼苗培育情况

以榕树气生根介质的大刺鳅水花，孵出的前三天，其发育生长良好，第4 d 开始死亡，第5 d全部死亡.以木麻黄针叶介质的大刺鳅水花孵出前三天，有部分水花死亡.其余在孵出7 d内生长状况良好.第8-15 d，有大部分水花相继死亡.经25 d的精心管理，剩余鱼苗体长约3 - 4.5 cm.

2.4 水质处理与疾病预防控制结果

在每天更换水和水质控制的条件下，溶氧量和pH值较为稳定，虽利用二溴海因进行杀菌，但水质细菌控制效果不佳，部分鱼受细菌感染尾部受伤部位开始发白，后长白絮状物，每天泡3%-5%氯化钠溶液5 min.但伤口依然没有有效控制，会继续蔓延，亲鱼不再躲避在PVC管内，独自在鱼缸角落慢游，不进食，3-5 d后死亡.

2.5 染色体核型分析

染色体的相对长度相对绝对长度而言，更具有可比性和稳定性.染色体的相对长度、臂比及类型按Leven 等［26］标准公式计算，相对长度=（每个染色体的长度/全部染色体长度）×100；臂比值=长臂长度/短臂长度；着丝粒指数=（短臂长度/该染色体长度）×100.参考Matthey［27］的建议，亚端部和端部着丝粒染色体的臂数记为1，中部和亚中部着丝粒染色体的臂数记为2.选择状态良好的5 个细胞中期分裂相图像，经放大后，对数码照片上的染色体逐条进行测量并计算其相对长度、臂比指数，着丝粒指数，然后取平均值，结果如图1所示，大刺鳅的染色体2n=48，为二倍体，未见性染色体和随体.大刺鳅核型公式为：2n=18m+5sm+M，NF=96；根据表4 获得的臂比指数等染色体参数数据，大刺鳅的染色体为正、中或近中部着丝点染色体.大刺鳅染色体着丝粒指数变化范围为33.33 - 50.00；臂比值范围在1.0 - 2.0之间.根据Stebbins［28］的核型分类标准及Arano［29］的核型不对称系数计算方法，大刺鳅的核型为2A型，核型不对称系数：59.03%，对称程度较高.

表4 大刺鳅染色体核型分析数据

图1 大刺鳅染色体核型

3 讨论

3.1 亲鱼选择与培育

野生状态下的大刺鳅，通过科学的人工驯养、培育，亲鱼能够在人工环境中生长、摄食饲料并达到性成熟，其繁殖状态比野生大刺鳅更为可控和预测，在亲鱼的选择与培育中应尽量选择经过规范化驯养的大刺鳅.

3.2 人工催产与受精

在注射催产药后，24 h内亲鱼有排卵现象，要注意观察，另在人工授精过程中要充分搅拌均匀以受精，否则未受精卵细胞会发生病变，引起水质灾难性变化.鉴于人工催产对亲鱼的伤害，一般亲鱼在催产后存活率不高.

3.3 人工孵化与幼苗培育

孵化率的高低主要由受精卵的质量、孵化水温的控制、水体溶解氧的含量和水霉病的控制情况所决定.其中榕树气生根缸的水霉病难以控制，较为严重，导致孵化率低.两个缸的受精卵来自同一批亲鱼，因此可能是由于榕树气生根缸在将卵移到榕树气生根介质上时，没有轻刷均匀，许多受精卵聚集在一起，缺氧、感染水霉病，这需进一步进行探究.

人工孵化过程中幼苗死亡，分析原因可能是：（1）孵化缸充气过大，会导致大刺鳅水花腹部卵膜破损；充气过小，孵化缸溶解氧偏低；（2）水体有害生物繁殖过多，尤其水霉病爆发频繁，因设备原因且无法进行彻底消毒，导致幼苗死亡率高，后期还需要进行设备改造升级，以增加水质调节能力.

3.4 染色体核型分析的意义

全世界的鱼类种类丰富，但在脊椎动物中，鱼类染色体小、数目多，对其展开研究较难.鱼类具有巨大的经济价值，对其展开核型研究分析是有必要的，对进一步开展细胞遗传学和分子生物学的研究工作、开发鱼类资源有重要的意义［27-30］.目前，鱼类染色体的研究在取材方面大多选择分裂增殖能力强的头肾细胞，体内注射短期培养法和体细胞体外培养法是制备鱼类染色体标本常用的方法，本次实验采用的是体内注射短期培养法，对于一些离水即失活的鱼类则不适合采用此法［31］.染色体的形态与数目是物种的特征之一，染色体核型代表一个物种或个体在染色体水平上的表型，通过物种间染色体的差别可以对生物进行分类并探讨其亲缘关系，同时也可以为生物的演化提供线索.不同实验室条件下的实验处理、实验材料的区域性，核型分析结果会略微有差异，染色体组型在一般情况下仅仅是对物种染色体特征粗略描述.

本次实验获得大刺鳅染色体2n=48，与国内已报道的大多数鱼类染色体数一致［32］.大刺鳅的染色体核型研究至今未见有公开文献报道，本实验的研究为了解大刺鳅细胞水平遗传学特征补充了新资料.

综上所述，本次实验通过建立大刺鳅人工繁殖系统，对亲鱼注射催产激素进行催产、人工挤精、挤卵和授精，分析了大刺鳅产卵量、受精率、孵化率和幼苗存活率；为进一步优化探索大刺鳅的人工繁殖方法与技术，为大刺鳅资源保护、开发利用提供理论基础.同时，采用（PHA）体内注射法短期培养大刺鳅头肾细胞，添加秋水仙素等操作处理后进行染色体制备及核型分析，阐述了大刺鳅的染色体形态数目特征，为进一步深入研究大刺鳅及其他鱼类遗传特性提供参考与借鉴.