下调PTEN对喉返神经挤压损伤大鼠的干预作用及机制研究

王殿一 武峙璇

喉返神经损伤主要发生在甲状腺手术中，是其常见的并发症，通过挤压、横断、结扎等多种途径均能导致喉返神经损伤。相关研究认为，喉返神经损伤，会因为带麻痹导致患者的声音产生嘶哑、呛咳，严重的患者会出现窒息，威胁生命[1]。轻度的喉返神经损伤会自行恢复，但是严重的喉返神经损伤会导致永久性麻痹。喉返神经损伤发病原因相对复杂，解剖结构较深[2]，因此寻找积极有效的关于喉返神经损伤诊断、治疗方案对患者具有重要作用。人第10号染色体缺失的磷酸及张力蛋白同源基因(phosphatase andtensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)属于内源性PI3K抑制剂，主要在神经元细胞核、细胞体、再生轴突中表达。有研究显示，通过抑制PTEN活性，有助于外周神经生长[3]。PTEN敲除后，通过调控PI3K/Akt外周神经修复信号通路，参与皮质脊髓神经再生过程[4]。本文研究下调PTEN表达对喉返神经挤压损伤模型大鼠干预作用及可能的相关机制，为临床治疗喉返神经挤压损伤提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选取40只健康清洁级雄性大鼠，鼠龄6～9周，平均鼠龄(8.5±0.5)周；体重200～260 g，平均体重(230.6±15.5)g；由上海市第一人民医院动物实验中心提供[动物许可证号：SYXK(沪)2009-0086]。所有大鼠养殖在干净笼子里，3～5只为1笼，室温22～25℃，相对湿度40%～60%，自由饮食和饮水，饲养1周。

1.2 主要试剂与仪器 PTEN腺病毒(上海赛业生物技术有限公司)；3%的戊巴比妥钠、PBS、Ficoll液(上海利康消毒高科技有限公司)；纤维喉镜(日本奥林巴斯)；SYBRPremixExTaq荧光定量PCR试剂盒(日本Takara)；PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin一抗(美国NEB)；10%甲醛、凝胶缓冲液、TBST(上海生工生物技术有限公司)；透射电镜(荷兰飞利浦公司)。

1.3 方法

1.3.1 喉返神经挤压损伤模型建立:参考吴涛等[5]的方法，将40只大鼠随机抽取30只，使用3%的40 mg/kg戊巴比妥钠给予腹腔麻醉，放置在无菌手术操作台上，对手术部位进行常规消毒。在大鼠颈部正中位置做切口，长度为2 cm，皮肤切开后将带状肌分离后，甲状腺、双侧气管食管沟完全暴露，通过显微镜引导在大鼠甲状腺右侧下5 mm位置，沿着心脏方向，将喉返神经轻柔游离7 mm。采用微血管夹对大鼠游离的喉返神经中间5 mm挤压2 min。微血管夹取出后，将伤口关闭。手术后对大鼠进行保暖，分笼喂养。死亡3只，剩余27只，分为模型组、下调组、上调组，每组9只。另外10只分为假手术组，进行常规麻醉后，将喉返神经游离后将手术切口闭合，不做其他处理。

1.3.2 建立下调PTEN慢病毒表达载体:下调组为PTEN腺病毒为腺病毒介导，瞬时转染均由(上海赛业生物技术有限公司合成)。PTEN下调序列：GATCT TGACCAATGG CTAATTCAAG AGATTAGCCA TTGGTCAAGA TC。PTEN上调序列：GCCAG CTAAAGGTGA AGATTTCAAG AGAATCTTCA CCTTTAGCTG GC。将病毒溶液按照一定的比例对细胞进行转染，培养16 h后将原有的培养基去除，使用PBS清洗干净再次更换培养基，观察转染情况。通过微量加样器提取适量的病毒溶液，在大鼠神经损伤局部注射。假手术组和模型组不进行注射。

1.3.3 PTEN mRNA表达检测:定量PCR检测PTEN mRNA基因表达 采集空腹静脉血液样本5 ml，置于一次性真空无抗凝剂的采血管中，使用Ficoll液分离单个核细胞。TRIzol提取细胞RNA，经过电泳检测RNA并定量，经过逆转录合成cDNA。之后进行实时荧光定量PCR实验，探针或SYBR 反应25 μl，反应条件满足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40个循环,设置标准组和空白对照。将PCR反应实验前3～15个循环荧光信号作为荧光本底信号，调节基线，采用2-ΔΔCt分析PTEN mRNA表达。

1.3.4 杓状软骨运动角度检查:主要在纤维喉镜下通过截图观察大鼠杓状软骨间夹角(杓间角)，即最大开放角度，采用PSCC软件分析实验数据。

1.3.5 声学改变、甲杓肌神经诱发电位图、喉返神经纤维观察:应用肌电图/诱发电位仪，将大鼠喉返神经游离后，使用同心针电极选择大鼠右侧甲状软骨板前中1/3的位置下缘内侧1 mm处进针，刺激电极，记录4组大鼠声学图和甲杓肌神经诱发电位图。通过透射电镜检查4组大鼠喉返神经纤维。

1.3.6 病理组织观察:将大鼠腹腔麻醉后，断头处死后，快速提取大鼠甲杓肌及环杓后肌，去除包膜，在0.9%氯化钠溶液中漂洗，在10%甲醛中固定24 h，制作病理组织切片，HE染色。

1.3.7 PI3K/Akt/GSK-3β通路相关蛋白表达:采用Western blot检测，将采集到的标本10 000×g离心处理10 min，对上清液进行提取后，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4℃环境下5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次为5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min。DAB显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 4组大鼠PTEN mRNA表达比较 与假手术组相比，模型组、下调组、上调组PTEN mRNA表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，下调组PTEN mRNA表达降低，上调组PTEN mRNA表达升高，具有统计学意义(P<0.05)；与下调组相比，上调组PTEN mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠PTEN mRNA表达比较

2.2 下调PTEN对大鼠杓状软骨运动角度的影响 与假手术组相比，模型组、下调组、上调组杓状软骨运动最大角度降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，下调组杓状软骨运动最大角度升高，上调组杓状软骨运动最大角度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与下调组相比，上调组杓状软骨运动最大角度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠杓状软骨运动角度比较

2.3 下调PTEN对大鼠声学改变的影响 假手术组和下调组大鼠发出尖锐的高叫声，高振幅持续较好的波形；模型组和上调组大鼠发出声音嘶哑，振幅较小且不稳定的窄波。见图1。

2.4 下调PTEN对大鼠甲杓肌神经诱发电位图的影响 模型组甲杓肌神经诱发电位波幅(0.73±0.16)V与上调组(0.59±0.17)V、假手术组(2.53±0.85)V、下调组(3.03±0.96)V比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组潜伏期(1.00±0.02)ms与上调组(0.98±0.01)ms、低于假手术组(0.98±0.01)ms、下调组(1.00±0.02)ms比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.5 下调PTEN对大鼠喉返神经纤维的影响 假手术组大鼠喉返神经纤维未发生病变，黑色箭头表示髓鞘，白色箭头表示雪旺细胞表现正常；上调组和模型组神经纤维髓鞘释放，脱髓鞘十分严重，肿胀，被巨噬细胞吞噬，神经丝不断溶解。下调组神经纤维髓鞘肿胀逐渐降低，有新生髓鞘产生，血旺细胞被包围。见图3。

2.6 4组大鼠病理组织观察 假手术组组织中肌细胞核以及肌纤维分布基本保持一致，肌纤维排列紧密，肌束分布集中，肌间隙相对较少。模型组病理组织中肌细胞核、肌纤维排列紊乱，肌间隙扩大；上调组病理组织中发现肌纤维萎缩，肌间隙不断扩大，肌纤维断裂。下调组组织中肌纤维排列逐渐恢复，肌束分布相对集中。见图4。

2.7 下调PTEN对大鼠PI3K/Akt/GSK-3β通路相关蛋白的影响 与假手术组相比，模型组、下调组、上调组的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，下调组的PI3K、Akt、GSK-3β、Myogenin蛋白表达水平升高，上调组的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与下调组相比，上调组的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4，图5。

表4 4组大鼠PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白比较

3 讨论

喉返神经损伤均有声带不同位置的瘫痪，常会导致患者的吼功能、神经功能出现障碍，属于耳鼻喉头颅外科疾病，临床中主要通过外科手术、药物进行保守治疗。喉返神经移植修复手术能够促进喉返神经损伤修复，不仅需要神经再生成功，还需要靶细胞将突触连接重新建立，促进生理功能恢复，如果神经再生发展较为缓慢，常会导致机体肌肉、运动萎缩，神经恢复的结果不太理想[6,7]。因此寻找积极有效的治疗手段对患者具有重要意义。

PTEN在机体中主要以未磷酸化PTEN和磷酸化pPTEN存在，其中PTEN作为内源性PI3K抑制剂，属于轴突再生的一种抑制信号以外周神经元表达为主[8]。相关研究显示，以siRNA抑制PTEN能促进成熟神经元轴突再生长，对横断大鼠轴突生长也有一定的促进作用[9]。本研究结果显示，下调组PTEN mRNA表达降低，上调组PTEN mRNA表达升高，说明下调PTEN慢病毒表达载体建立成功。喉内肌主要是通过喉返神经、喉上神经支配，甲杓肌属于喉内肌，在患者发音、呼吸过程中具有重要作用，当喉返神经发生损伤会影响机体肌肉[10]。有研究认为，喉返神经损伤会导致甲杓肌失去神经营养功能，对其结构、功能带来较大的影响[11]。本文中上调组和模型组声图表示为小振幅窄波，下调组显示为高振幅，说明下调PTEN能促进大鼠发音功能恢复。与徐文等[12]研究结果一致。下调组甲杓肌神经诱发电位波幅较高，神经纤维髓鞘肿胀逐渐降低，有新生髓鞘产生，说明下调PTEN能促进神经纤维以及肌肉运动恢复。

本研究中，下调组的杓状软骨运动最大角度明显升高，上调组的杓状软骨运动最大角度明显降低，说明下调PTEN能够促进杓状软骨运动恢复。Rosko等[13]研究指出，喉返神经挤压模型建立以后，随着时间的延长，大鼠声带运动逐渐得到改善，说明神经挤压伤具有一定的自我修复能力。神经营养因子的主要功能是降低神经变性，促进轴突生长，有助于神经分化再生，抑制疾病的发展[14]。PI3K通过诱导神经突起向轴突分化，PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在体外轴突过程中具有重要作用[15]。相关研究指出，PI3K抑制剂通过将层粘连蛋白促进AKT-PH-GFP聚集，向神经突起方向延伸[16]。PI3K-AKT信号通路是一个关键的介导神经元的营养因子支持、抗凋亡的生存途径，它不仅参与生存，而且与生长、定向分化机制都有关[17,18]。神经生长因子与Trk受体结合，通过接头蛋白Gab-11和RAS激活PI3K，使PI3K磷酸化并激活下游分子，分别为AKT和REK-1/2，活化AKT参与多种信号转导通路[19-21]。

Myogenin参与失神经骨骼肌再生过程，不仅能促进合成骨骼肌特异性胚胎性受体以及收缩蛋白，避免肌细胞凋亡过快。当神经发生损伤CNTF会从髓鞘、雪旺细胞中被释放，受损的轴突会直接吸收CNTF。本研究结果中，下调组PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达升高，上调组PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达降低，说明下调PTEN表达将PI3K/Akt/GSK-3β通路激活，能促进PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表达上调，在喉返神经修复过程中具有重要作用。

综上所述，下调PTEN表达对喉返神经挤压损伤模型大鼠干预效果显著，下调PTEN下游PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，参与大鼠喉返神经修复过程，为临床治疗喉返神经损伤提供新的研究方向。