老年人胰腺癌组织中HER2表达及临床意义

崔自强 窦剑 高庆军 赵鑫 姜翀弋 曹经琳 王巍

胰腺癌起病隐匿，早期无明显症状和体征，少数早期胰腺癌患者侥幸因定期体检发现，而多数因为有黄疸或者腹痛等症状就诊的胰腺癌多数已经晚期。胰腺癌侵袭强，极容易发生远处转移，是恶性程度极高的肿瘤之一，发病率与致死率接近，5年生存率非常低[1]。胰腺癌常见于老年人，随着我国人口老龄化的进展，胰腺癌越来越成为影响人民生命健康的重大公共卫生问题。人类上皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是人表皮生长因子受体家族成员之一，HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，在细胞增殖、分化和生存的过程中起重要的调节作用，在多种实体肿瘤(如乳腺癌、胃癌等)的发生发展过程中也发挥重要作用。鉴于HER2过表达对胰腺导管腺癌有诊断和预测预后的意义，且在老年人胰腺导管腺癌中过表达率显著高于中青年患者[1]。本研究以病理材料为基础，利用免疫组化Envision二步法检测HER2蛋白在接受根治性切除术的老年人胰腺导管腺癌患者标本中表达情况，分析HER2表达与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2002年1月至2011年12月复旦大学附属华东医院普外科接受根治性手术经病理确诊的≥60岁老年人胰腺导管腺癌病例67例。其中男36例，女31例；年龄60～82岁，平均年龄(68.03±5.69)岁，中位年龄66.00岁。肿瘤位置：胰头部41例，胰体尾部26例；病理分级：高分化8例，中分化44例，低分化15例；参照2019年WHO消化系统肿瘤分类：T1期10例，T2期39例，T3期18例；N0期40例，N1期和N2期共27例；神经侵犯28例，切缘阳性病例13例；淋巴结转移27例，选取石蜡保存完整并可再次利用取材的病例，最终20例淋巴结转移灶入组。16例>60岁老年正常胰腺组织取自2010年01月到2012年12月在华东医院普外科因为其他疾病行胰腺十二指肠切除术或胰体尾切除术的患者。本研究经过医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①病理诊断为胰腺导管腺癌；②年龄≥60岁；③经胰腺癌根治性手术。

1.2.2 排除标准：①肿瘤有远处转移；②肿瘤侵犯腹腔干或肠系膜上动脉；③围手术期死亡。

1.3 方法 兔抗人多克隆HER2抗体、GT1009系列抗体稀释液和GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒均购自DAKO公司。pH值6.0柠檬酸缓冲工作液、pH值9.0 PBS缓冲液、蒸馏水均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。选择合适蜡块，切片厚度4 μm，1片置于普通载玻片，另选1切片置于洁净的涂胶载玻片上，放置于60℃ 1 h干燥，普通载玻片行HE染色，对涂胶载玻片应用免疫组化Envision二步法染色。首先，对涂胶载玻片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水冲洗。然后，3%过氧化氢溶液孵育30 min，消除内源性过氧化酶活性，蒸馏水冲洗。再入pH值6.0柠檬酸缓冲工作液，于99℃水浴30 min，自然冷却，蒸馏水冲洗。再行PBS冲洗，每次5 min，3次。然后滴入HER2一抗(1∶300)37℃孵育1 h。再行PBS冲洗，每次5 min，3次。使用Envision试剂，37℃ 1 h。然后二抗37℃孵育30 min。再行PBS冲洗，每次5 min，3次。然后DAB显色3～5 min(显微镜下控制)，苏木素复染，盐酸酒精分化，烘干。最后二甲苯透明，中性树脂封片。由病理科医生读片，参考Hercep Test评分判定标准[2]进行评定，并记录结果。

1.4 HER2蛋白表达参考HercepTest评分判定标准进行评定 阳性细胞为细胞膜染色，并根据细胞膜染色程度和所占的比率进行分级，其中细胞膜染色细胞所占比率<10%为0；细胞膜染色为淡黄色，所占比率≥10%为1+；细胞膜染色为黄色，所占比率≥10%为2+；细胞膜染色为棕黄色，所占比率≥10%为3+。定义2+～3+为过表达。

2 结果

2.1 老年人胰腺导管腺癌与正常胰腺组织中HER2表达情况 67例老年人胰腺导管腺癌中，有19例HER2蛋白表达为0，22例1+，16例2+，10例 3+，过表达者共26例，过表达率占38.8%。在16例老年人正常胰腺组织中HER2表达0、1+分别为13例和3例，无过表达者，过表达率为0。老年人胰腺癌组织中HER2过表达率显著高于老年人正常胰腺组织，差异有统计学意义(P=0.003)。见表1。

表1 老年人胰腺导管腺癌和正常胰腺组织中HER2蛋白表达情况 例(%)

2.2 老年人胰腺导管腺癌中HER2表达与临床病理特征的关系 在67例患胰腺导管腺癌的老年患者中，男36例，过表达18例(50.0%)；女31例，过表达8例(25.8%)，男性过表达率显著高于女性(P=0.043)。所有患者中，肿瘤中分化者和低分化者过表达率分别为40.9%和40.0%，两者几乎相同；肿瘤高分化者过表达率为25.0%，低于前两者，但差异均无统计学意义(P=0.693)。根据2019年WHO消化系统肿瘤分期，进行T分期和N分期，入组病例中无T4分期，因为T分期高度依赖肿瘤大小，故T分期也基本反映肿瘤大小。在67例患胰腺导管腺癌的老年患者中，T1期10例，过表达5例，过表达率为50.0%；T2期39例，过表达14例，过表达率为35.9%；T3期18例，过表达7例，过表达率为38.9%；T1期胰腺导管腺癌HER2过表达率高于T2期和T3期，但差别均无统计学意义(P=0.717)。因为所涉及病例中N2分期仅有1例，故将N1期和N2期合并。N0期40例，过表达者16例，过表达率为40.0%；N1+N2期27例，过表达10例，过表达率为37.0%，N0期胰腺导管腺癌HER2过表达率略高于N1+N2期，差异无统计学意义(P=0.807)。在老年人胰腺导管腺癌HER2过表达率与性别相关，男性过表达率显著高于女性，两者差异有统计学意义(P=0.043)，但与肿瘤部位、肿瘤分级、T分期、N分期、神经侵犯、切缘阳性无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 老年人胰腺导管腺癌组织中HER2蛋白表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.3 老年人胰腺导管腺癌淋巴结转移灶中HER2表达 20例胰腺导管腺癌淋巴结转移灶中，HER2蛋白无表达者5例，表达1+者11例，表达2+者3例，表达3+者1例，分别占25.0%、55.0%、15.0%和5.0%。其中，淋巴结转移灶中HER2表达2+/3+者共4例，过表达率为20.0%。见表3。

2.4 老年人胰腺导管腺癌淋巴结转移灶中HER2表达与原发灶比较 胰腺导管腺癌原发灶与淋巴结转移灶中HER2表达同为0/1+者11例，同为2+/3+者1例，表达一致者占60.0%；胰腺导管腺癌原发灶与淋巴结转移灶中HER2表达不同者共8例，占比40.0%。未发现老年人胰腺导管腺癌淋巴结转移灶中HER2表达与原发灶相关(P=0.727)。见表4。

3 讨论

胰腺癌起病隐匿，发病早期无典型症状，多数患者发现时已经是晚期，且胰腺癌恶性程度极高，极容易发生远处转移，故致死率与发病率非常接近。据报道，胰腺癌5年总生存率仅约10%[3]，此数据远低于其他实体肿瘤。随着我国人口老龄化加剧、生活方式及饮食习惯的改变，胰腺癌的发病率必将增加，势必成为影响国民生命健康的公共卫生问题[4]。据Rahib等[5]的推测，到2030年在西方国家胰腺癌可能将成为恶性肿瘤中的第二位死因，胰腺癌通常发生于老年人，其发病率最高的年龄段是60～80岁[6]。跟很多实体肿瘤一样，胰腺癌的发病与人体衰老关系密切，对老年人胰腺癌分子生物学和临床病理特征的研究，将有助于我们进一步了解胰腺癌的发生发展的规律，从而为其防治提供新的思路[7]。基于上述原因，本研究以67例≥60岁老年人胰腺导管腺癌的病理石蜡为对象，应用免疫组化Envision二步法，依据Hercep Test评分判定标准进行评定HER2表达的情况，并分析其与临床病理特征的关系。

HER2基因由Shih提出[8]。人HER2基因定位于染色体17q21，分子量约为185 kU，作为人表皮生长因子受体家族成员之一，HER2蛋白是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，并在调节细胞增殖、分化和生存的过程中发挥重要作用[9]。由于HER2缺乏特异性配体，在某些特定条件情况下，过度表达的HER2可与自身或与家族其他成员形成二聚体，进而发生自身磷酸化和磷酸化其他成分，最终激活Ras蛋白。通过TPK-Ras-MAPK途径，催化细胞核内的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，导致基因转录或关闭，并最终调节细胞分裂和分化[10]。

HER2过表达与多种实体肿瘤的发生发展及肿瘤的诊治相关。研究显示，HER2在乳腺癌中过表达率为20%～30%，HER2过表达的乳腺癌病例预后差，对化疗和激素治疗不敏感，过表达是患者预后差的独立危险因子[11]，针对乳腺癌HER2的靶向治疗取得了较好的结果，并被列入临床诊治指南。在胃癌中，HER2过表达率为7%～34%[12]。胃癌中HER2过表达率相差较大，原因可能与所用试剂和评分体系不同有关，到目前为止，胃癌尚未有统一的HER2评分系统。尽管胃癌的过表达率相差较大，但针对HER2的靶向治疗(如赫赛汀)在胃癌中已经进入临床诊治指南。HER2在部分实体肿瘤(特别是乳腺癌)的诊治过程中的革命性的改变，为其他实体肿瘤(包括胰腺癌)带来了希望。Harder等[13]对17例胰腺癌患者采用联合曲妥珠单抗和卡培他滨进行治疗，结果显示，12周后无病生存患者占23.5%，总生存期中位数为6.9月。尽管无病生存期和总生存期并没有比标准化疗显著提高，但胰腺癌患者对曲妥珠单抗表现出很好的耐受性。临床试验证明了针对HER2靶向治疗的安全性。除此之外，针对HER2的免疫治疗也初步显示了可喜的进展，比如，CAR-T疗法治疗HER2阳性的胰腺癌Ⅰ期临床试验，已证明安全性和较好的临床结果[14]。

在胰腺癌HER2表达的研究也有不少。Safran等[15]研究显示胰腺癌组织中HER2蛋白过表达率为21%，其中可根治切除者、有局部浸润者和有远处转移者的过表达占率分别为16%、17%和26%，随着胰腺癌分期的越来越晚，HER2过表达率也逐渐增加。因而Safran等认为患者HER2蛋白表达在不断增加也提示着胰腺癌患者病情的逐步恶化。Komoto等[16]对129例无远处转移、无腹腔播散的胰腺导管腺癌的根治性切除肿瘤标本进行了免疫组化，发现HER2蛋白过表达者占61.2%，过表达者中位生存时间为14.7个月，显著低于正常表达者的20.7个月，因此，胰腺癌患者HER2蛋白过表达提示预后差。Koka等[17]对308例胰腺癌病例进行免疫组化，结果仅48例HER2过表达者，过表达率为16%，胰腺癌HER2过表达者平均生存期为11个月，正常表达者生存期为7个月。这个结果与Komoto等[16]研究结果相反。前人对胰腺癌HER2表达的研究中，过表达率相差甚多，我们认为可能与所用试剂、免疫组化方法和评分体系不同有关。规范的检测仍需要大量的实验去积极探索。在前期，我们对109例接受根治性手术经病理确诊的胰腺导管腺癌病例进行研究，利用免疫组化Envision二步法检测HER2蛋白，参考HercepTest评分判定标准进行评定，我们发现胰腺癌中HER2过表达占34.9%，HER2表达强阳性的患者术后生存期明显延长，并且发现老年人胰腺癌组织中HER2过表达率明显增高[1]。另外胰腺癌患者发病时多为老年人。基于上述两点，我们将研究进一步深入，专门研究老年人胰腺癌HER2表达的规律。

本研究针对67例60岁以上有明确诊断的胰腺导管腺癌病例，且均为无远处转移、无血管侵犯的根治性标本，所得结果为在67例老年人胰腺导管腺癌组织中HER2表达0、1+、2+、3+分别占28.4%、32.8%、23.9%和14.9%，过表达率为38.8%，略高于我们先期报道的所有年龄段胰腺癌HER2的过表达率(34.9%)[1]。但仍在Aumayr等[18]报道的胰腺癌HER2蛋白过表达率(4%～50%)的范围内。本研究结果显示，作为对照组的16例正常胰腺组织未见HER2过表达者，与胰腺导管腺癌HER2表达有显著差别(P=0.003)。我们认为，对于60岁以上人群，HER2过表达可作为胰腺正常组织和胰腺导管腺癌组织的区分标志。老年人胰腺导管腺癌组织中HER2蛋白表达与性别显著相关(P=0.043)，男性患者HER2过表达率高于女性患者。这一结论在既往的研究中未提及。但有关HER2表达与性别相关机制的研究亦未发现。在67例患胰腺导管腺癌的老年患者中，肿瘤位于胰头者41例，过表达15例，过表达率为36.6%；肿瘤位于胰腺体尾部者26例，过表达11例，过表达率为42.3%。胰腺体尾部的胰腺导管腺癌HER2过表达率略高于胰头部，但两者无显著差异(P=0.640)。在67例患胰腺导管腺癌的老年患者中，肿瘤高分化者、中分化者、低分化者HER2过表达率分别为25.0%、40.9%和40.0%，中分化者与低分化者HER2过表达率几乎相同，均高于高分化者，但差别均无统计学意义(P=0.693)。本研究根据2019年WHO消化系统肿瘤分期，进行T分期和N分期，因为T分期高度依赖肿瘤大小，故T分期也基本反映肿瘤大小，故本研究未再行HER2过表达率与肿瘤大小的相关性分析。本研究显示，T1期、T2期和T3期胰腺导管腺癌HER2过表达率分别为50.0%、35.9%和38.9%，T1期胰腺导管腺癌HER2过表达率高于T2期和T3期，但差别均无统计学意义(P=0.717)。N0期、N1+N2期胰腺导管腺癌HER2过表达率分别为40.0%和37.0%，N0期胰腺导管腺癌HER2过表达率略高于N1+N2期，差别无统计学意义(P=0.807)。Tsiambas等[19]对50例胰腺导管腺癌组织研究，结果显示过表达者占20%，认为HER2蛋白表达与肿瘤分级相关，与分期无关。而在次研究中未发现HER2过表达与肿瘤分级、肿瘤分期相关。在我们研究的胰腺癌中，肿瘤无神经侵犯有39例，过表达17例，过表达率为43.6%；肿瘤侵犯神经者28例，过表达9例，过表达率为32.1%，低于无神经侵犯者，但两者无显著差别(P=0.343)。胰腺癌的神经侵犯提示胰腺癌恶性程度高，容易扩散。尽管有无神经侵犯与HER2过表达率无显著差别，但本次研究中无神经侵犯者HER2过表达率更高，似乎预示着胰腺癌HER2过表达率高者恶性程度低。既往认为，手术切缘阳性是术者手术切除不彻底所导致，与其他因素无关。但随着手术技术的进步和肿瘤生物行为的深入研究，发现有些肿瘤手术切缘阳性与其本身具有特殊的生物学行为相关，故我们将手术切缘列为研究对象。本研究中手术切缘阴性者54例，过表达23例，过表达率为42.6%；手术切缘阳性者13例，过表达3例，过表达率为23.1%。手术切缘阳性的胰腺导管腺癌HER2过表达率低于手术切缘阴性者，但两者无显著差别(P=0.195)。总之，在老年人胰腺导管腺癌HER2过表达率与性别相关，男性过表达率显著高于女性，两者有统计学差异(P=0.043)，但与肿瘤部位、肿瘤分级、T分期、N分期、神经侵犯、切缘阳性无明显相关性(P>0.05)。本研究对老年人胰腺导管腺癌组织HER2表达与其淋巴结转移灶中HER2表达分析，未发现老年人胰腺导管腺癌淋巴结转移灶中HER2表达与原发灶相关(P=0.727)。说明在胰腺癌病灶转移的过程中，HER2表达的情况也可能发生变化。

本研究样本量较小，均为胰腺癌根治术后的标本，可行胰腺癌根治术的病例肿瘤分期多数为Ⅰ期和Ⅱ期，分期较早，且为单中心研究，存在一定的选择偏倚。部分病理取材时所取淋巴结数目较少，未达到15个，影响N分期，可能会影响胰腺导管腺癌HER2表达与N分期的关系。

综上所述，胰腺导管腺癌是常见的且恶性程度极高的肿瘤，通常发生于老年人，HER2过表达在胰腺导管腺癌病例中占一定比例，HER2表达在部分胰腺导管腺癌的发生发展过程中可能起重要作用。另外，在老年人胰腺导管腺癌组织中HER2表达有其特殊之处，老年患者的胰腺导管腺癌HER2过表达率可能与性别有关，老年男性胰腺导管腺癌组织中HERE2过表达高于老年女性患者，但其机制需进一步研究。