蛋白激酶在寻常型银屑病表皮增殖中的作用研究

杨旭芳，王晓彦，张晓艳

（1.北京丰台右安门医院，北京 100054；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100050；3.中日友好医院，北京 100029）

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病。角质形成细胞过度增殖是其重要的组织学特点。其病理生理学表现为细胞周期明显缩短。研究发现银屑病角质形成细胞呈现出抵抗凋亡。细胞凋亡的异常和细胞周期的加速可导致表皮的过度增殖。因此探索导致角质形成细胞凋亡失调以及细胞周期加速的原因对于研究银屑病的发病机制至关重要。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B[PI3K/PKB（Akt）]信号转导途径是哺乳动物细胞中重要的信号通路，在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥着极其重要的作用。其任一环节的异常都可能导致细胞的异常增殖与分化。

为了进一步探索Akt与银屑病的相关性，笔者采用免疫组化及免疫印迹的方法对银屑病皮损及正常表皮中Akt各亚类及磷酸化形式（p-Akt）的表达及细胞定位进行研究，进一步明确Akt在银屑病发病中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 寻常型银屑病患者30例，均来自门诊，其中男15例，女15例，年龄18～60岁，平均37.3岁，病程1个月～28年，经临床和组织病理确诊的斑块型进行期寻常型银屑病患者，病情严重程度为中度。皮损表现为鳞屑性斑块，组织病理表现为角质增厚，角化不全，Munro微脓肿，颗粒层变薄或消失，棘层规则增厚，真皮乳头血管扩张充血；进行期表现为新皮疹不断出现，旧皮疹不断扩大。皮损面积为2%～10%[1]。2个月内无系统应用激素、免疫抑制剂、维甲酸类药物。1个月内无外用糖皮质激素、维甲酸类药物、维生素D3类似物。身心健康，无其他内科疾病，无病毒性肝炎等传染病病史及遗传病病史。对照组来自整形外科手术剩余的正常皮肤组织，年龄18～60岁。本研究经医院伦理委员会通过并与患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 皮肤组织和表皮的取材 上述病例和正常对照经外科手术取材获得全层皮肤组织，植皮刀取材获得表皮组织，取材部位为四肢、臀部或背部。外科手术取材的皮肤组织经福尔马林固定，石蜡包埋。植皮刀取表皮：银屑病患者取材厚度为0.4 mm，正常人皮肤取材厚度为0.2 mm，所取表皮立即置液氮速冻、-70℃保存。

Akt1（兔抗人单克隆抗体）购于美国Epitomics公司，Akt2（鼠抗人单克隆抗体）购于美国SantaCrus公司，Akt3（鼠抗人单克隆抗体）购于美国Novus公司，SP-9000免疫组化试剂盒购自美国Zymed公司，羊抗人Akt多克隆抗体（1∶50稀释）、兔抗人Phospho-Akt（Ser473）单克隆抗体（1∶100稀释）、兔抗人 Phospho-Akt（Thr308）单克隆抗体（1∶100 稀释）均购于美国SantaCruz公司。

1.2.2 蛋白印记检测 ①组织充分切碎，加总蛋白提取液，匀浆，冰上放置20 min，再匀浆，将匀浆液吸出放到1.5 mL离心管中。超声3次，3 s/次，9 000 r/min，离心10 min，取适量上清。②采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测盒（上海碧云天生物技术有限公司）对蛋白浓度进行检测。③内参选择β-actin，取蛋白电泳1 h，后转移至硝酸纤维膜，并封闭。④加入一抗，4℃条件下过夜，而后加入酶标二抗，37℃孵育60 min，使用增强化学发光试剂孵育2 min，在自动电泳凝胶成像分析系统下自动成像，分析目的蛋白条带的平均灰度值，进行统计学分析。

1.2.3 免疫组化 ①60℃烤片，二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，抑制内源性过氧化物酶，高压热抗原修复，血清封闭液，一抗（Akt：1∶50；p-Akt：1∶50）孵育4℃过夜；二抗复合物，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察、拍片。②免疫组化结果判定：采用日本尼康公司的ECLIPSE 80i图像采集与分析系统对组织切片进行半定量分析。

1.3 统计学分析 所有数据采用SPSS 13.0统计软件分析，各组检测数据均以±s表示，免疫染色的强度进行光密度测定，蛋白印迹用灰度值表示。在银屑病皮损及正常表皮中Akt光密度均值及灰度值比较均采用两样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病皮损及正常皮肤中Akt1的蛋白表达

2.1.1 免疫组化 正常皮肤中Akt1主要表达于表皮基底层角质形成细胞的胞浆内，呈阳性染色，基底层上角质形成细胞的表达为弱阳性见图1a；真皮血管内皮细胞胞核、胞浆均表达弱阳性见图1b，毛囊、皮脂腺、汗腺细胞表达阳性见图1c、d。银屑病皮损中，Ak1在表皮全层均有表达，但表达较弱，阳性细胞主要表现为细胞浆着色（真皮血管内皮细胞、淋巴细胞、附属器的表达与正常皮肤无明显差别）见图2a。银屑病皮损表皮中Akt1的平均光密度值与正常表皮相比，差异无统计学意义（P＞0.05），图像分析结果见表1。

图1 免疫组化检测正常皮肤中Akt1蛋白表达的结果

图2 免疫组化检测银屑病皮损中Akt1蛋白表达的结果

表1 银屑病皮损及正常表皮Akt1，Akt2，及Akt3的平均光密度值 （±s）

表1 银屑病皮损及正常表皮Akt1，Akt2，及Akt3的平均光密度值 （±s）

分组 n Akt1 Akt2 Akt3银屑病皮损 30 0.217 0±0.014 4 0.215 7±0.015 0 0.217 5±0.015 0正常表皮 20 0.216 7±0.031 4 0.216 7±0.014 5 0.216 6±0.024 8 t-0.075 0.213 0.160 P 0.941 0.832 0.745

2.1.2 蛋白印迹 与正常表皮相比，银屑病皮损中Akt1的蛋白水平无明显差异见图3，统计学分析见表2。

图3 银屑病皮损及正常表皮中Akt1的蛋白印迹

2.2 银屑病皮损及正常皮肤中Akt 2的蛋白表达

2.2.1 免疫组化 在正常皮肤表皮中，Akt2主要表达于基底层角质形成细胞的胞浆内，基底层上角质形成细胞呈弱阳性表达见图4a；真皮血管内皮细胞胞浆染色呈弱阳性见图4b，个别淋巴细胞胞核表达弱阳性，毛囊、皮脂腺、汗腺细胞的表达均呈阳性见图4c、d。在银屑病皮损中，Akt2在表皮全层细胞胞浆内均有较弱表达，真皮血管内皮细胞、淋巴细胞、附属器的表达与正常皮肤无明显差别见图5a。银屑病皮损表皮中，Akt2的平均光密度值与正常表皮相比，差异无统计学意义（P＞0.05），图像分析结果见表1。

图4 免疫组化检测正常皮肤中Akt2蛋白表达的结果

图5 免疫组化检测银屑病皮损中Akt2蛋白表达的结果

2.2.2 蛋白印迹 与正常表皮相比，银屑病皮损中Akt2的蛋白水平无明显差别见图6，统计分析见表2。

图6 银屑病皮损及正常表皮中Akt2的蛋白印迹

表2 银屑病皮损及正常表皮Akt1，Akt2，及Akt3的平均灰度值 （±s）

表2 银屑病皮损及正常表皮Akt1，Akt2，及Akt3的平均灰度值 （±s）

分组 n Akt1 Akt2 Akt3银屑病皮损 30 129.474 0±7.355 6 179.396 8±10.030 8 253.012 8±13.537 7正常表皮 20 127.759 7±5.164 0 181.594 8±12.420 5 260.333 4±14.980 0 t 0.714 -0.515 -1.357 P 0.482 0.611 0.187

2.3 银屑病皮损及正常皮肤中Akt3的蛋白表达

2.3.1 免疫组化 正常皮肤中，Akt3在表皮全层均有表达，基底层表达最强，主要为胞浆染色，基底层上角质形成细胞的胞浆染色呈弱阳性，少部分胞核呈阳性，部分真皮血管内皮细胞表达呈弱阳性见图7a。银屑病皮损中，Akt3在表皮全层细胞的胞浆、胞核染色均为阳性，但以胞核为主见图8a，真皮血管内皮细胞、淋巴细胞、附属器的表达呈阳性见图8b、c，与正常表皮相比差异无统计学意义。银屑病皮损表皮中，Akt3的平均光密度值与正常表皮相比，差异无统计学意义（P＞0.05），图像分析结果见表 1。

图7 免疫组化检测正常皮肤中Akt3蛋白表达的结果

图8 免疫组化检测银屑病皮损中Akt3蛋白表达的结果

2.3.2 蛋白印迹 与正常表皮相比，银屑病皮损中Akt3的蛋白水平无明显差异见图9，统计学分析见表2。

图9 银屑病皮损及正常表皮中Akt3的蛋白印迹

2.4 寻常型银屑病中p-Akt（Ser473）磷酸化水平正常表皮内，磷酸化p-Akt（Ser473）仅于基底层角质形成细胞的胞质内呈阳性表达见图10a；而银屑病皮损中，p-Akt（Ser473）的表达则分布于全层角质形成细胞的胞质与胞核内，呈阳性表达见图10b。银屑病皮损表皮中p-Akt（Ser473）的平均光密度值高于正常表皮，差异有统计学意义（P＜0.01），图像分析结果见表3。

图10 免疫组化检测银屑病皮损及正常表皮p-Akt（Ser473）的磷酸化水平

表3 银屑病皮损及正常表皮磷酸化Akt的平均光密度值 （±s）

表3 银屑病皮损及正常表皮磷酸化Akt的平均光密度值 （±s）

分组np-Akt（Ser473）p-Akt（Thr308）银屑病皮损 30 1.500 2±0.211 6 0.600 3±0.135 5正常表皮 20 0.655 2±0.099 9 0.231 0±0.054 6 t-16.151 -11.035 P 0.000 0.000

2.5 寻常型银屑病中p-Akt（Thr308）磷酸化水平正常表皮内，磷酸化p-Akt（Thr308）表达于基底层角质形成细胞的胞质内,见图11a；而银屑病皮损中，p-Akt（Thr308）在全层角质形成细胞的胞质与胞核内的染色呈阳性见图11b。

图11 免疫组化检测银屑病皮损及正常表皮p-Akt（Thr308）的磷酸化水平

3 讨论

银屑病是一种常见的由多基因遗传决定的、环境因素刺激诱导的慢性复发性炎症性皮肤病，其发病机制至今尚未明确，严重影响患者的身心健康和生活质量。其病理生理学特点为角质形成细胞增殖过度、凋亡失调及异常分化，具体表现为细胞周期明显缩短，有丝分裂周期从正常的311 h缩短为37.5 h，表皮更替时间从28 d缩短为3～4 d[2-3]。细胞凋亡的减弱和细胞周期的加速可导致角质形成细胞的过度增殖，引起表皮肥厚。

近年来关于PI3K/Akt信号转导通路在银屑病发病机制的研究中越来越受到关注。有关PI3K/Akt通路在银屑病发病机制中的作用，既往研究发现，银屑病皮损PI3K基因及其亚单位PI3K-P110蛋白特异性高表达[4]，银屑病皮损内P-Akt的蛋白水平和Akt的激酶活性增强[5]。银屑病皮损表皮PI3K/Akt信号通路可能被异常活化，PI3K-P110表达的升高可使PI3K活性增强，活化的PI3K磷酸化AKT的Thr308位点及Ser473位点，继而导致Akt活性的升高[6]。本文通过免疫组化对银屑病皮损及正常表皮中p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）水平进行检测，结果显示银屑病皮损中磷酸化Akt水平明显升高，提示银屑病皮损中Akt的活性增强。此结果与既往研究一致。

至今，在哺乳动物细胞中共发现Akt有3个成员：Akt1、Akt2、Akt3。Akt的 3个亚型在氨基酸序列上有80%以上的同源性，而且结构上很相似，但功能却不完全相同[7]。既往研究通过免疫组化检测到银屑病皮损中Akt3的表达明显高于正常皮肤，而Akt1、Akt2的表达与正常皮肤无明显差异[8]。而本研究通过免疫组化和蛋白印迹2种方法同时对银屑病皮损和正常表皮中Akt的3个亚型进行检测，结果显示银屑病皮损中Akt1、Akt2、Akt3的表达与正常表皮无明显差异。提示Akt1、Akt2、Akt3参与正常皮肤角质形成细胞以及毛囊附属器等细胞的生长和代谢等过程，只有Akt被活化的PI3K磷酸化后才会参与银屑病的发生。

Akt的活性表达需要磷酸酶基因（PTEN）来调节，PTEN 可将 PI（3，4，5）P3中的 3’-磷酸去磷酸化为PI（4，5）P2，从而导致Akt失活，而PTEN的低表达，失去对Akt的抑制作用，使Akt活性增强[9]。活化的Akt可磷酸化下游叉头转录因子（FOXOs）不同的位点，如 FOXO1（Thr24、Ser256、Ser319）、FOXO3a（Thr32、Ser253、Ser315）、FOXO4（Thr28、Ser193、Ser258）[10]。FOXO被磷酸化后与14-3-3蛋白结合，诱导FOXO分子构象改变，暴露核输出信号（NES），导致FOXO/14-3-3复合体从细胞核转入细胞质，同时遮蔽核定位信号（NLS）来抑制FOXO再进入细胞核，从而使其转录细胞周期及凋亡相关因子的作用丧失，导致细胞凋亡较少，加速细胞周期进程，从而引起细胞增殖[11]。已有研究表明银屑病皮损中PTEN表达下降，p-FOXO1表达升高[12]，故提示活化的Akt参与银屑病角质形成细胞过度增殖的病理生理学改变，与本文结果一致。

本研究发现，银屑病皮损和正常表皮中均有Akt1、Akt2、Akt3 的表达，且表达无明显差异，提示Akt的3个亚型参与正常角质形成细胞等生长和代谢，而与正常表皮相比，银屑病皮损中pAkt（Ser473）及pAkt（Thr308）的表达明显升高，提示银屑病皮损中Akt活性增强，可能活化的Akt参与银屑病角质形成细胞的过度增殖。