系统性红斑狼疮相关肺动脉高压患者循环miR-155、SOCS-3的检测水平及意义

杨金良，任占芬，罗寰，吴远慧，赵亚君，阮海玲，郑学军

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

肺动脉高压（Pulmonary hypertension，PAH）是肺动脉压力异常升高的一种病理状态，引起右心室肥大、右心衰竭甚至死亡，也是系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者死亡的主要原因。SLE是一种多系统疾病，由自身抗体的产生、补体激活和免疫复合物沉积引起，有广泛的临床表现[1]。SLE可引起严重的PAH，在中国SLE研究协作组的注册研究中，SLE合并PAH的发生率占SLE总例数的3.8%，死亡率位于SLE导致脏器损伤患者的第3位[2]。SLE合并PAH具有进展迅速，预后较差的特点，因此早诊断、早治疗是提高患者生活质量的关键。微小核糖核酸-155（miR-155）在许多自身免疫性疾病，如风湿性关节炎、多发性硬化症和SLE中出现表达异常[3]。黄阳等[4]研究发现SLE患者血清miR-155水平降低，可能作为潜在的诊断指标和治疗靶点。细胞因子信号抑制物（Suppressor of cytokine signaling，SOCS）-3是近年来新发现的一类负向调节蛋白，可抑制多种细胞因子信号通路，积极调控炎性反应[5]。SLE患者血清中鉴定出较高水平的SOCS-3，可能促进针对SOCS-3靶点的新化合物的开发及治疗方法的应用。目前鲜有miR-155及SOCS-3在PAH患者中的研究，鉴于PAH与SLE的密切关系，本研究通过检测SLE合并PAH患者血清中miR-155及SOCS-3的表达水平，探究二者与SLE合并PAH的关系，以期为临床治疗该病提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月—2019年12月于本院风湿免疫科及皮肤科住院接受治疗的55例SLE患者作为研究对象（观察组），临床和实验室检查均符合2019欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病协会SLE分类标准[6]，其中男26例，女29例，年龄26～61岁，平均（48.15±10.28）岁。按照肺动脉收缩压的高低将SLE患者分为单纯SLE无PAH组（35例），连续多普勒超声检查肺动脉收缩压≤35mmHg，年龄27～59岁，平均（47.58±9.67）岁；SLE 合并 PAH 组（20例），连续多普勒超声检查肺动脉收缩压＞35 mmHg，年龄26～62岁，平均（48.79±10.32）岁。所有患者均根据临床症状、经胸心脏超声心动图结合实验室检查等确诊为PAH患者，并符合PAH诊断标准[7]。另选取同期健康体检者40例作为对照组，其中男21例，女 19例，年龄 29～63岁，平均（48.24±10.36）岁。3组受试者年龄、性别基线资料差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。收集受试者年龄、性别、体质量指数（BMI）、心率、吸烟史、饮酒史等一般资料，并使用Philips Sonos 5500超声诊断仪，经胸超声探头频率为2.5 MHz，检测SLE患者主动脉瓣环内前后径（MA）、左心室射血分数（LVEF）、室间隔（IVST）、左心室后壁（LVPWT）、左室舒张末期内径（LVEDD）等心脏超声临床检测指标。

SLE患者纳入标准：①所有SLE患者均符合2019欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病协会SLE分类标准[6]；②临床资料完整；③均为首次确诊病例。排除标准：①高血压相关、呼吸道疾病相关、甲状腺疾病相关及其他原因不明的肺动脉高压；②不能配合本研究患者；③存在严重的肺部病变，如重度肺间质纤维化或肺功能检查表明肺活量≤70%预计值；④合并有严重肝肾功能损害、其他系统严重疾病或免疫缺陷症等。本研究获得本院伦理委员会批准后实施，所有研究对象家属签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 Trizol试剂（美国Invirotrogen公司），逆转录试剂盒（北京天根生物科技公司），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（大连TaKaRa公司），荧光实时定量PCR仪（美国Applied biosygtems公司），低温高速离心机、Nano Drop 2000（美国Thermo Scientific公司），Philips Sonos 5500超声诊断仪（英国菲利普公司），-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司），Milli-Q超净水净化系统（美国Millpore公司），引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 所有SLE患者均于入院后24 h内、体检者于体检当日清晨空腹抽取外周静脉血5mL，静置30 min，室温3 000 r/min，离心半径8 cm，离心15 min，吸取上清液分别装入EP管中，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 检测3组受试者血清中miR-155、SOCS-3表达水平 按照Trizol法提取受试者血清样本中总RNA，分光光度计测总RNA纯度及浓度，根据逆转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，以U6及GAPDH基因为内参，miR-155、SOCS-3、U6、GAPDH 引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；40个PCR循环（95 ℃，10 s；60 ℃，60 s，72 ℃，15 s）。采用 2-ΔΔCt方法计算受试者血清中miR-155、SOCS-3相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学分析 运用SPSS 20.0处理数据。计数资料用率（%）表示，行χ2检验；计量资料均符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，行 t检验。受试者工作特征曲线（ROC）分析血清miR-155、SOCS-3水平对SLE合并PAH的诊断效能。Logistic回归分析SLE合并PAH的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者一般资料的比较 2组间年龄、性别、BMI水平及吸烟、饮酒例数差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，观察组患者心率、MA、IVST、LVPWT、LVEDD 水平均显著升高（P＜0.05），LVEF水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 受试者一般资料的比较 （±s）

表2 受试者一般资料的比较 （±s）

心率（次/min）对照组 40 48.24±10.36 21/19 21.85±3.24 75.42±10.23观察组 55 48.15±10.28 26/29 21.51±3.86 87.67±22.58 t/χ2 0.042 0.253 0.453 3.197 P 0.967 0.615 0.652 0.002组别 n 年龄（岁）性别（男/女）BMI（kg/m2）吸烟史（%）18（45.00）25（45.45）2.464 0.116 LVEDD（mm）23（57.50） 25.84±3.56 64.41±8.62 8.24±1.68 7.61±0.91 42.82±3.65 27（49.09） 28.16±3.85 50.35±5.83 10.65±2.31 10.69±1.37 58.46±7.68 0.657 2.992 9.484 5.605 12.364 11.925 0.418 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000饮酒史（%）MA（mm）LVEF（%）IVST（mm）LVPWT（mm）

2.2 受试者血清miR-155、SOCS-3表达水平的比较 3组受试者血清miR-155、SOCS-3水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组、SLE无PAH组、SLE合并PAH组miR-155水平依次降低，SOCS-3水平依次升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 受试者血清miR-155、SOCS-3表达水平的比较 （±s）

表3 受试者血清miR-155、SOCS-3表达水平的比较 （±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与 SLE 无 PAH 组相比，#P＜0.05。

组别 n miR-155 SOCS-3对照组 40 5.26±1.13 0.68±0.15 SLE 无 PAH 组 35 3.48±0.95* 1.25±0.23*SLE 合并 PAH 组 20 2.14±0.48*# 1.57±0.36*#F 76.916 109.330 P 0.000 0.000

2.3 ROC曲线分析血清miR-155、SOCS-3水平对SLE合并PAH的诊断效能 ROC曲线分析结果显示，血清miR-155预测SLE合并PAH的曲线下面积（AUC）为 0.875（95%CI：0.805～0.945），截断值为3.081，敏感度为94.0%，特异度68.0%。血清SOCS-3预测SLE合并PAH的AUC为0.709（95%CI：0.823～0.811），截断值为1.436，敏感度为60.0%，特异度78.0%。二者联合检测预测SLE合并PAH的AUC为 0.889（95%CI：0.823～0.955），敏感度为 94.0%，特异度74.0%。见图1。

图1 ROC曲线分析血清miR-155、SOCS-3水平对SLE合并PAH的诊断效能

2.4 Logistic回归分析SLE合并PAH的影响因素以SLE患者是否发生PAH为因变量，以miR-155、SOCS-3表达水平为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示，miR-155是SLE合并PAH的保护因素（P＜0.05）；SOCS-3是 SLE 合并 PAH 的危险因素（P＜0.05）。见表 4。

表4 Logistic回归分析SLE合并PAH的影响因素

3 讨论

SLE是一种临床上常见的慢性炎症性自身免疫系统疾病，通常表现为多系统多脏器损伤，几乎累及全身每一个器官。PAH是一种累及肺部小血管的疾病，其发病原因是不断增加的肺循环阻力引起了肺动脉压力升高以及右心功能衰竭[8]。SLE患者心脏病变可导致扩张型心肌病和心衰等，造成右心室压力升高，进而引起PAH。虽然SLE合并PAH患病率不高，但我国人口基数大，总的患病例数约40万人，且该病病情隐匿、进展迅速，确诊时很多患者已处于心功能等级Ⅲ～Ⅳ级（共Ⅳ级，等级越高病情越重），导致治疗效果较差，病死率较高[9]。因此SLE合并PAH的早期诊断对及时发现和治疗该病显得尤为重要。近年来，随着人们对机体免疫调节机制认识的不断深入，发现多种参与SLE致病机制中的miRNA 及SOCS，包括 miR-155、SOCS-3等。

miRNA是一类19-22核苷酸的内源性非编码RNA，可转录后调控信使RAN（mRNA）。miRNA通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区结合，抑制mRNA延伸，衰变和切割mRNA来发挥其功能。越来越多的研究表明，miRNA是免疫系统发育和功能的关键调节剂，例如在T和B淋巴细胞的分化以及免疫反应中有重要调控作用[10]。miRNA在自身免疫性疾病的患者和动物模型中表达失调，如在多发性硬化症，类风湿性关节炎和SLE的发生和发展中起到重要作用[11]。其中miR-155由于其在自身免疫疾病等炎性反应中的重要作用而成为许多研究的重点。研究发现在SLE小鼠模型中，脾细胞中miR-155表达升高，并且与SLE易感性密切相关[12]。虽然miR-155在SLE患者尿液中过度表达，但在SLE患者血清中却较低[13]。SOCS-3是SOCS家族的重要成员，其编码基因位于17q25.3染色体上，由225个氨基酸构成，相对分子质量为24 700。SOCS-3广泛分布于人体胸腺、肝脏、肺脏、肾脏等多种器官中，正常机体中SOCS-3表达水平比较低，但当大量的细胞因子、激素及生长因子存在时，SOCS-3会被迅速诱导表达，同时过度表达的SOCS-3又会抑制细胞因子介导的信号通路，进而形成一个负反馈调节的通路[14]。SOCS-3在SLE合并PAH患者中的研究较少，但由于SLE合并PAH发病时引起机体严重的炎性反应，刺激炎性细胞分泌炎性反应相关细胞因子，SOCS-3与细胞因子间存在负调控机制，所以探究SLE合并PAH患者体内SOCS-3水平对进一步了解SLE合并PAH发病机制有一定作用。本研究发现，对照组、SLE无PAH组、SLE合并PAH组血清miR-155水平依次降低，SOCS-3水平依次升高。提示miR-155、SOCS-3可能与SLE合并PAH的发病有关，推测SLE患者血清中低水平miR-155导致机体炎性反应程度加重，炎性反应刺激SOCS-3表达升高，进而抑制炎性因子过度表达，控制机体炎性反应水平，避免过度的免疫反应。戚倩如等[15]发现miR-155在SLE患者血清中呈低表达，有较高的预测效能。本研究经ROC曲线分析显示，血清miR-155、SOCS-3均能较好的预测SLE合并PAH，二者联合检测预测效能更高。提示miR-155、SOCS-3可能作为SLE合并PAH新的临床诊断标志物。本研究经Logistic回归分析，结果显示，miR-155是SLE合并PAH的保护因素，SOCS-3是SLE合并PAH的危险因素。提示低水平的miR-155及高水平SOCS-3可能与SLE合并PAH的发生有关。

综上所述，SLE合并PAH患者血清中miR-155水平降低，SOCS-3水平升高，二者呈负相关，均能较好的预测SLE合并PAH，与该病的发生密切相关。本研究也存在纳入因子较少，仅在血清mRNA水平上分析相关性，下一步可以结合病变组织中二者表达水平进一步探究SLE合并PAH致病机制。