生物滤池去除恶臭气体工艺填料优选研究

于承泽， 李鸣晓， 孟繁华， 郝 艳， 刘东明， 侯佳奇*

1.中国环境科学研究院， 环境基准与风险评估国家重点实验室， 北京 100012 2.中国环境科学研究院， 国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室， 北京 100012 3.青岛农业大学资源与环境学院， 青岛市农村环境工程研究中心， 山东 青岛 266109

注： ①—氨气气体罐；②—硫化氢气体罐；③—甲苯气体罐；④—甲硫醇气体罐；⑤—空气泵； ⑥—混合气体室；⑦—S1反应塔；⑧—S2反应塔；⑨—S3反应塔；⑩—固体取样口；—气体取样口；—出气口.图1 恶臭气体去除模拟装置Fig.1 Simulation device for odor removal

城市生活垃圾处置一直是环保领域关注的热点之一. 目前，城市生活垃圾的处理方法主要有卫生填埋、堆肥和焚烧等[1-3]. 伴随着垃圾分类政策的推行，将垃圾分类后进行堆肥法处理，具有无害化程度高、减量化效果明显、处理成本低等优点，因此得到了广泛应用[4-7]. 但生活垃圾处理厂在堆肥过程中常常产生各种恶臭气体，对厂内及周边大气环境造成污染[8-9]. 恶臭气体对人体的危害巨大，是人体健康的一大安全隐患[10-13]. 我国GB 14554—1993《恶臭污染物排放标准》严格规定了氨气、硫化氢、甲硫醇等8种恶臭污染物的排放浓度范围. 氨气、硫化氢和甲硫醇作为水处理、畜牧业、石化炼制过程和堆肥过程中比较常见的代表性恶臭气体，其处理工艺成为国内外学者研究的热点[14-16]. Jia等[17]研究发现，甲苯是实际工业生产中挥发性有机物的主要有害物质，且甲苯在高浓度下具有明显的环境毒性，对人体健康和生态环境影响较大[18-19]. 目前恶臭气体处理处置技术主要分为物理处置、化学处置、生物处置3种，其中以生物处置最为常用，对环境产生的次生危害也较小[20]. 在生物法中，生物滤池过滤法是一种可以有效处理恶臭污染物的方法. 已有研究[21-25]发现，湿度、温度、pH、填料种类、压降等都会影响生物滤池去除污染物的性能. 目前针对填料种类选择的研究很多[26-28]，但是针对不同腐熟度堆肥作为填料的研究报道较少[18,29]. 在生物滤池除臭过程中，填料的形态、温度、湿度等理化性质变化会导致其负载的微生物种类、数量发生很大的变化[30-32]，然而相关学者研究接种剂的较多[33]，但对填料物质组成以及微环境带来的微生物生长变化的报道较少，有待深入研究.

鉴于此，该研究采用柱试验，以生活垃圾为研究对象，采用机械-生物四级处理工艺的二次发酵7 d(S1)、20 d(S2)及成品肥(S3)3种不同腐熟程度的堆肥产品作为生物滤池填料，考察其对氨气、硫化氢、甲苯、甲硫醇4种恶臭气体的去除效果；探究生物滤池填料在除臭前后氨氮、硝态氮、亚硝态氮、硫酸盐含量的变化；并结合PCR-DGGE技术，研究处理臭气过程中微生物的变化规律. 通过分析，优选恶臭气体去除的最适填料，从微环境角度揭示除臭机理，达到以废治废的目的，对生活垃圾处理厂除臭生物滤池填料的选择有一定指导意义.

1 材料与方法

1.1 试验设置

1.1.1生物滤池装置

试验所用的生物滤池装置见图1. 其中，恶臭气体模拟装置采用4个8 L的钢瓶作为配气盛装容器，钢瓶口部装有气体流量计与压力仪表盘，接五通管通入混合气体室；混合气体室内设有长短不一的隔板，以达到充分混匀的目的. 生物滤池反应器为有机玻璃材质，圆柱形封闭装置，底面直径0.2 m，高度1.6 m；铺设石英砂垫层做衬底，高度0.05 m；装置底部设置1个进气口，顶部设置一个出气口，在距离底部0.4、0.8、1.2 m处分别设置1个气体取样口和1个固体取样口. 整套装置进出气口均设置气体流量计与压力表，用于监测生物滤池运行过程中的进气流量、出气流量及压降.

1.1.2恶臭气体模拟

将氨气、硫化氢、甲苯与甲硫醇4种气体分别存储于配气钢瓶中作为模拟气，进气流量均为2.5 L/min，进气浓度分别为200、500、100、80 mg/m3，停留时间为12.5 min，在混气室充分混合后，通入生物滤池反应器.

1.1.3生物滤池填料

秸秆取自白洋淀，粉碎至颗粒直径为1～2 cm备用. 堆肥样品取自上海市某固体废物处理厂，该厂采用机械-生物四级处理工艺：生活垃圾经初步机械分选后进行一次生物发酵，一次发酵完成后进行二次机械分选去除难降解物质，再进行二次生物发酵进一步腐熟得到成品肥. 在二次发酵工艺7 d、20 d及成品时取堆肥样品，粉碎至颗粒直径在5 cm以下，分别与秸秆按照质量比5∶2充分混合，调节含水率在45%～60%之间，作为填料放入3个生物滤池反应器，依次记为S1、S2、S3.

1.1.4样品采集

每个反应器设置3个气体取样口用于恶臭气体的采集，分别位于距离反应器底部0.4、0.8、1.2 m处. 将采气袋连接气体采样口后打开采样口气体阀门，采集3个平行样本. 固体样品通过反应器上的固体取样口采集，每个反应器在距离反应器底部0.4、0.8、1.2 m处分别设置3个固体取样口，模拟现场环境上、中、下3个高度. 从恶臭气体通入开始后，每隔2 d分别在3个不同高度处取样并进行后续分析.

1.2 测试分析

1.2.1恶臭气体

氨气含量根据HJ 534—2009《环境空气中氨的测定 次氯酸钠-水杨酸分光光度法》测定；硫化氢含量根据《空气和废气监测分析方法》(第四版)测定；甲苯和甲硫醇含量根据GB/T 14678—1993《空气质量 硫化氢、甲硫醇、甲硫醚和二甲二硫的测定 气相色谱法》测定.

1.2.2填料理化指标

填料样品采用0.01 mol/L的氯化钙，按样水质量比1∶10 在室温条件下以150 r/min的水平振荡1 h后，取50 mL滤液以 3 000 r/min离心30 min，定性滤纸过滤. 氨氮(NH4+-N)含量根据GB 7479—1987《水质 铵的测定 纳氏试剂比色法》测定；硝态氮(NO3--N)含量根据GB/T 7480—1987《水质 硝酸盐氮的测定 酚二磺酸分光光度法》测定；亚硝态氮(NO2--N)含量根据GB/T 7493—1987《水质 亚硝酸盐氮的测定 分光光度法》测定；硫酸盐含量根据BS 5551-4.5—1993《固体肥料中无机酸可溶硫酸盐含量测定方法》测定.

1.2.3填料微生物指标

1.2.3.1PCR-DGGE分析

微生物指标测试委托北京市理化分析测试中心完成，堆肥样品经脱腐缓冲溶液洗涤去除腐殖质，用BioTeke基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA. 首先对细菌16S rDNA的V3区进行PCR扩增，PCR反应体系(50 μL)：10×PCR缓冲液5 μL；dNTP 4 mL；引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 40～50 ng、Ex Tag(大连TaKaRa公司)1.5 U、灭菌高纯水补齐至50 μL. 引物357F-GC的序列为5′-GC-clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，引物517R的序列为5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，引物GC-clamp的序列为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGG-3′. 扩增条件：94 ℃预变性5 min；之后进行循环，94、48、72 ℃下分别保持1 min，30个循环；循环结束后72 ℃保持10 min；再将100 μL的PCR产物浓缩至30 μL. 最后将20 μL PCR产物进行DGGE电泳，聚丙烯酰胺胶浓度为8%，细菌变性梯度为35%～70%. 电泳条件为60 ℃，20 V预电泳10 min，130 V下电泳6 h. 使用Gel-Red染色剂染色30 min，然后在凝胶成像系统(Bio-Rad, USA)进行拍照分析.

1.2.3.2优势条带的切胶回收和测序分析

用无菌手术刀将优势条带切下，放在2 mL无菌离心管中，捣碎后加入60 μL TE缓冲溶液，4 ℃下放置24 h，取10 ng DNA进行第二轮PCR扩增，引物为不带CG夹子的上述引物，扩增条件同1.2.3.1节，扩增产物交由北京市理化分析测试中心测序. 将测序结果提交到GenBank数据库中，利用BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对，寻找同源性最高的序列，同源性以一致序列的占比作为标准.

1.3 数据分析

采用Origin 2017、Quantity One 4.6.2等软件对试验数据进行处理.

2 结果与讨论

2.1 不同腐熟程度填料处理下恶臭气体性能

由图2可见，3个反应器对恶臭气体的平均去除率均在96%以上. 各反应器对氨气的去除率差别不显著，其中S3对氨气的去除率最高，平均值为98.99%. 这可能是由于氨气通入后被吸附在填料中以氨氮形式存在，经过恶臭气体的驯化，微生物可将氨氮转化为硝态氮和亚硝态氮，从而使氨气去除率升高[34]. S2、S3对硫化氢气体的去除率较高，分别为98.26%、98.14%；不同腐熟程度的填料对甲苯去除率的顺序表现为S3 > S1 > S2. 3种填料对甲硫醇的去除效果最好，不同时间段内S2、S3对甲硫醇的去除率均为100%，S1对甲硫醇的去除率除第6天(96.84%)和第8天(96.00%)外，也均为100%. 填料中的硫化氢和甲硫醇被脱硫菌转化为硫酸盐，其中3种填料对硫化氢的去除率较低，可能是因为填料中的硫酸盐还原细菌将部分硫酸盐还原成了硫化氢[35]. 3种填料相比，S1发酵时间短，蛋白质类物质含量高，而胡敏酸、富里酸等物质含量较少，对氨气、硫化氢、甲苯起去除作用的菌群存活困难，除臭微生物不易在填料上生长挂膜，不利于微生物对氨气的吸附降解；而腐熟程度较高的S3发酵时间长、理化性质稳定，更有利于对恶臭气体去除起作用菌群的生长[36].

2.2 填料理化性质变化

2.2.1氨氮含量变化

由图3可见，恶臭气体通入第1天，S1、S2、S3的氨氮含量均在0～1 mg/kg之间. 随着氨气的继续通入，前2 d氨氮含量升幅较大，第4天升幅减缓，而氨气在生物滤池运行过程中的去除率较高(见图2)，所以氨氮的累积可能是由于生物滤池对氨气的吸收过程为主导过程，该过程中氨气在生物滤池内转化为氨氮[37]. 第8天，S1、S2、S3的氨氮含量达到峰值，分别为9.07、8.33、7.25 mg/kg；随后开始下降并在第20天降至最小值，分别为1.77、1.28、1.19 mg/kg，可能是由于随着氨气的通入，与氨气转化相关的微生物活性增加，此时生物滤池内微生物对氨氮的转化是主导过程. 对比3种填料中氨氮含量的变化趋势可以发现，S3的氨氮含量在前3 d明显低于S1、S2，说明S3填料对氨气的吸收作用最好；S3的氨氮含量在第8天到达峰值时，仅为7.25 mg/kg，明显低于S1、S2，可能是因为S3中微生物群落对氨氮的转化效率更高，微生物物种优势更明显[38].

图3 不同腐熟程度填料中氨氮含量的变化Fig.3 Changes of ammonia nitrogen in different maturity fillers

2.2.2硝态氮含量变化

在生物滤池处理过程中，填料中的氨氮会经过硝化细菌的转化作用转化为硝态氮. 由图4可见，S1、S2、S3的硝态氮含量分别由起始的0.76、0.63、0.43 mg/kg增至第20天的7.87、7.10、6.98 mg/kg. S1、S2、S3的硝态氮含量整体上均呈增加趋势，主要是因为发酵过程中硝化细菌的转化作用将氨氮转化为硝态氮[39]. 3种填料中，S3的硝态氮含量始终低于S1、S2，说明S3中可能存在较多的反硝化细菌，将硝态氮转化为氮气释放[40]. 14～16 d内，3种填料中硝态氮含量均有小幅下降，而后继续增加，可能是由于此时反硝化细菌群落有所增加，消耗掉部分硝态氮所致.

图4 不同腐熟程度填料硝态氮含量的变化Fig.4 Changes of nitrate nitrogen in different maturity fillers

2.2.3亚硝态氮含量变化

氨气经过生物滤池吸附后，以氨氮形式存在于填料中. 经过硝化细菌的硝化作用，氨氮不仅可以转化为硝态氮，还会转化为亚硝态氮. 不同腐熟程度填料中亚硝态氮含量的变化如图5所示. S1、S2、S3的亚硝态氮含量在前2 d基本保持不变，可能是由于对应时间内氨氮的含量变化呈直线上升趋势(见图3)，是氨气的吸附作用占主导，微生物的硝化作用不明显. 由图5可见，S1、S2、S3的亚硝态氮含量整体呈上升趋势，第20天达到最大值，分别为0.55、0.46、0.63 mg/kg. S3中亚硝态氮含量在前8 d明显低于S1、S2，第8天后三者持平，可能是因为通入恶臭气体的中后期，S3中将氨氮转化为亚硝态氮的微生物数量有所增加.

图5 不同腐熟程度填料亚硝态氮含量的变化Fig.5 Changes of nitrite nitrogen in with different maturity fillers

2.2.4硫酸盐含量变化

3种填料中硫酸盐的平均含量在前4 d变化不显著，4～12 d内呈上升趋势，之后开始下降. S1在第14天达到最大值，为35.00 mg/kg，S2、S3在第12天达到最大值，分别为40.74和45.35 mg/kg. 硫化氢气体的去除率在4种恶臭气体中最低(见图2)，之前也有研究[41]表明，硫酸盐还原细菌可以产生硫化氢气体，因此硫酸盐含量的降低可能是因为发酵后期硫酸盐还原细菌的增加，将部分硫酸盐还原成硫化氢. 4～12 d内硫酸盐含量增加，可能是填料中的脱硫菌将硫化氢和甲硫醇吸附降解为硫酸盐；后期硫酸盐含量又出现降低趋势，可能是因为持续通入恶臭气体驯化了填料中与硫酸盐降解有关的微生物.

图6 不同腐熟程度填料硫酸盐含量的变化Fig.6 Changes in sulfate content of different maturity fillers

2.3 成品肥填料中微生物群落变化

2.3.1成品肥填料中细菌DGGE图谱分析

由于成品肥填料对恶臭气体的去除效果最好，因此对成品肥填料除臭过程中的样品进行微生物测试. 通过变性梯度凝胶电泳技术能将片段分离成长度相同而碱基组成不同的DNA序列. 每一泳道中条带的数量代表菌落的多样性，条带的亮度强弱代表细菌数量的多少[42]. 由成品肥填料作为生物滤池填料时细菌的DGGE图谱(见图7)可以看出，12条泳道中明显分离的条带有20条，条带a、d、f、i、k、m等是每个泳道共有的，说明这几种微生物是此填料进化过程中共有的优势种群. 其中，d、f、i、k条带亮度明显，且随着时间的变化其亮度变化较小，说明这几种微生物在填料中占比较大、菌群结构稳定，受恶臭气体影响较小[43]. b、c、e、s、t条带前期未出现，在19 d后的3条泳道中均可见到，说明这3种细菌可能是经过恶臭气体驯化后保留下来的优势物种，恶臭气体的通入有利于其生存.

注：d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13、d15、d17、d19、d21、d23分别代表恶臭气体通入后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23天的填料样品. 下同. 图7 成品肥填料细菌DGGE图谱Fig.7 DGGE profile of bacteria communities in finished compost

条带b、c、e均为通入恶臭气体第19天时出现的新条带，与此同时f、i条带亮度逐渐减弱，说明恶臭气体通入后期微生物种群结构变化明显，可能是因为恶臭气体的不断通入，导致部分微生物难以生存，同时部分微生物得到外界条件驯化后适应恶臭气体环境成为优势种群[44-45]. 恶臭气体停止通入后，第21、23天泳道中条带数目和种类出现明显变化，部分条带消失，且新增条带较多，说明生物滤池运行过程中的优势微生物种与恶臭气体通入有关.

2.3.2细菌多样性结果分析

细菌的丰度(S)、多样性指数(H)、均匀度(E)在不同样品的不同泳道之间存在差异，由此可判断样品中微生物群落结构特征[46]，由表1可见，第15天细菌的丰度明显大于其他时间，结合硝态氮含量的降低分析结果来看，可能是因为气体通入第15天时，硝化细菌种类最多. 均匀度反映群落中不同物种分布的均匀程度，数值越接近1表明其分布越均匀[47]. 该研究中12组样品的均匀度差别不明显，且均大于0.996，表明填料的细菌群落结构稳定. 停止恶臭气体通入后，第23天时微生物样品中的丰度降至13，多样性指数也明显减小，为2.556，说明生物滤池运行过程中降解恶臭气体的除臭微生物发挥了主要作用.

表1 成品肥填料中 DGGE 条带丰度、多样性指数和均匀度

2.3.3生物滤池填料细菌聚类分析和主成分分析

为了比较3种填料的微生物群落相似性，对DGGE谱图进行UPGMA层次聚类分析，结果如图8所示. 按照相似程度划分，所有样品的细菌群落可以分为3组：① 7、9、11、13、15 d的细菌群落能较好地聚成一类，记为A组，可代表恶臭气体处理中期的细菌群落组成，其最大同源系数为71%. ② 1、3、5、17、19、21 d的细菌群落聚成一类，记为B组，可代表前期和后期的细菌群落组成，最大同源系数为67%，说明成品肥填料中细菌群落的相似性较高，即随着恶臭气体的通入，微生物群落的变化较小. ③23 d的细菌群落单独聚成一类，记为C组，代表末期细菌群落组成. 此外，1和17 d的细菌群落的最大同源系数为90%，远大于所有细菌群落的最大同源系数(53%)，说明随着恶臭气体通入时间的变化，成品肥填料中细菌群落又重新稳定，成品肥填料整体的生物稳定性较好，适合作为生物滤池的填料.

图8 细菌DGGE图谱的聚类分析结果Fig.8 Cluster analysis for DGGE profile of bacteria

注：样品间距离代表其相似性，空间上相聚越近的变量，其正相关程度越高.图9 细菌PCA分析结果Fig.9 PCA analysis diagram of bacteria

由图9可见，主成分1和主成分2的样品差异性累积贡献率分别达54.50%和68.73%，是不同样品间相似性差异的主要来源. 由于d23为恶臭气体停止通入后的样品，所以与其他样品距离较远，说明恶臭气体停止通入后填料中微生物的组成存在显著差异. d15与其他样品的距离也较远，是因为d15中细菌的丰度和多样性指数均大于其他样品(见表1)，填料的硝态氮含量等理化性质在此时发生变化. d1和d19距离较近，说明这两个样品在主成分上具有较大的相似性，二者分别是恶臭气体通入开始和通入结束时的样品，这表明成品肥填料的细菌群落结构较稳定.

2.3.4生物滤池填料细菌优势群落分析

成品肥填料条带的序列与NCBI数据库的比对结果如表2所示. 由表2可见，条带a、b、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、o、p、q、r、t的序列对比相似度均在97%以上. 细菌群落丝状菌属(Kineothrix)、芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)为优势菌群，在生物滤池运行过程中一直存在. 丝状菌属(Kineothrix)耐酸、耐干燥、耐缺氧、比表面积大，且对气态污染物有良好的吸附性能[48]，这些特点增强了填料中微生物对甲苯和硫化氢的吸附能力. 芽孢杆菌属(Bacillus)在好氧或兼性厌氧条件下会降解硫化氢气体，且在有氧条件下也可以利用氨氮、硝态氮和亚硝态氮，此外还能表现出有效的反硝化性能，是填料理化性质变化的主要因素[49-50]. 乳杆菌属(Lactobacillus)对去除氨气和硫化氢也有较好的作用[51]. 棒状杆菌属(Corynebacterium)和根瘤菌属(Rhizobium)分别对烃类与含氧类恶臭气体有较好的去除作用[52-53]. j条带对应的紫硫菌属(Allochromatium)是醌氧化还原酶的主要来源，主要作用是催化硫化物的氧化，在硫化氢、甲硫醇、硫酸盐的转化中起主要作用[54].

表2 条带序列的测定结果

12个样品中的细菌分属于7个属，结果如图10所示. 在刚通入恶臭气体第1天的填料中，丝状菌属(Kineothrix)、芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏属(Weissella)为优势菌属，相对丰度分别为26.9%、16.1%、18.0%. 在20 d的恶臭气体通入过程中，优势菌属相对丰度变化较小，说明成品肥填料中优势细菌群落稳定. 恶臭气体停止通入后，第21、23天样品中再次出现紫硫菌属(Allochromatium)和乳杆菌属(Lactobacillus)，且第23天样品中丝状菌属(Kineothrix)相对丰度降至15.8%，孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏属(Weissella)相对丰度分别增至20.9%、22.3%，与1～19 d样品的细菌群落存在差别. 不同时间样品间细菌优势菌属的变化表明，恶臭气体通入期间填料较稳定，停止通入后细菌群落发生明显变化，说明生物滤池运行过程中的优势物种与恶臭气体的通入有关，这与已有研究结果[55]相符.

图10 不同处理下属水平上细菌群落组成Fig.10 Composition of bacteria community at genus level under different treatments

3 结论

a) 成品肥(S3)填料对恶臭气体氨气、硫化氢、甲苯、甲硫醇的去除率最高，二次发酵7 d(S1)与20 d(S2)填料对恶臭气体的去除率较低. 相比于其他气体，3种生物滤池填料对甲硫醇的去除率最高，对硫化氢的去除率最低.

b) S1、S2、S3填料中氨氮与硫酸盐含量均呈先增后降的趋势，硝态氮、亚硝态氮含量均呈上升趋势，填料S3的理化性质变化与微生物群落变化趋势一致.

c) 成品肥填料经恶臭气体驯化后，以丝状菌属(Kineothrix)、芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏属(Weissella)为优势菌属. S3中微生物种群稳定，已形成驯化后的稳定生物群落，且其优势物种具有去除恶臭气体的功能.

d) S1、S2、S3作为生物滤池填料时的恶臭气体去除率、理化性质、微生物群落变化评估结果显示，S3对恶臭气体的处理效果最好、理化性质稳定，并含有除臭功能微生物，可优选为生活垃圾堆肥处理过程中的除臭生物滤池填料.