贫养分低有机质黄绵土中石油烃的生物去除特性及菌群结构变化

吴蔓莉， 李可欣， 侯爽爽， 许殷瑞， 王 丽， 王 娣， 郭西倩

1.西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 陕西 西安 710055 2.陕西省环境工程重点实验室, 陕西 西安 710055 3.西北水资源与环境生态教育部重点实验室， 陕西 西安 710055

利用生物强化和生物刺激技术修复石油污染土壤，具有经济、绿色、长效、无二次污染等优点，是目前广泛采用的土壤有机污染生物修复技术[1-3]. 生物强化是指向土壤中接种外源降解菌以对土壤中石油烃进行去除的方法[4]. 由于接种的降解菌可直接对目标污染物进行降解，因此具有针对性强、降解速度快、短期内即可对土壤中大部分石油烃进行有效去除等优点[5-8]. 文献报道的用于生物强化修复的石油烃降解菌主要有不动细菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、杆菌属(Flavobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、动胶菌属(Zoogloea)、诺卡氏菌属(Nocardia)等. 生物刺激是指在人工优化的条件下通过引入营养物、H2O2、O2、NO3-等电子受体刺激土壤中土著微生物的生长以降解污染物的方法[9-11]. 土壤养分是限制微生物活性的影响因素，当土壤中C/N接近10∶1时，微生物活性最好且对污染物的降解能力最强[12-13]. 石油污染土壤中由于外碳源的大量输入，土壤氮源相对不足，使土壤微生物活性受到抑制. 向土壤中补充氮素以提高土著微生物对石油烃的代谢活性是常用的石油污染修复方法[14-16]. 生物刺激修复具有费用低、对环境的影响小、对污染物降解快速等优点. 但是对于实际污染场地的修复，外加氮素对土壤微生物的激活作用受当地气候条件和土著菌群结构的影响较大，因此，需要通过前期修复预试验，确定生物刺激修复对土壤中石油烃的去除效率.

陕北油气开采区位于毛乌素沙地南缘与陕北黄土丘陵沟壑区接壤地带，土壤类型主要为黄绵土，具有土体疏松、软绵、土色浅淡等特点. 土壤中矿物盐含量高，有机质含量低，土壤贫瘠，土著微生物种类和数量较少. 近些年来，受陕北油田开发的影响，土壤受石油污染严重，亟需得到有效治理.

针对陕北黄土高原区土壤修复需求，该研究以陕北延长地区石油污染土壤为研究对象，比较接种降解菌和外源氮生物刺激两种方式对土壤中石油烃的去除效果，探究生物强化降解菌的生长存活特性与石油烃去除效率的关系，分析适合陕北污染土壤修复的氮源类型和最适C/N，以期为陕北油田区污染土壤的修复治理和生态环境恢复提供参考.

1 材料与方法

1.1 石油污染土壤的质地及理化性质

石油污染土壤采自陕北延长(109°33′E、36°14′N)某油井附近. 土壤经碎散、除杂、过筛(0.85 mm)后混匀. 土壤中总石油烃含量为 15 233 mg/kg.

土壤样品理化性质测定方法参考《土壤农化分析》[17]. 各指标测定方法和结果见表1.

表1 石油污染黄绵土的理化性质及土壤质地

1.2 石油烃降解菌群的筛选及鉴定

以石油污染土壤为降解菌的菌源，利用富集培养和平板划线法分离筛选石油烃降解菌. 筛选的详细过程：在无菌条件下将5 g石油污染土壤接种于50 mL灭菌的L9培养基〔Na2HPO4·12H2O 17.689 g，KH2PO43.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.12 g，2.5 mL微量元素(MnCl2·2H2O 23 mg，MnCl4·H2O 30 mg，H3BO331 mg，CoCl2·6H2O 36 mg，CuCl2·2H2O 10 mg，NiCl2·6H2O 20 mg，Na2MoO4·2H2O 30 mg，ZnCl250 mg，1 L去离子水〕中，30 ℃、150 r/min条件下振荡2 h. 静置，无菌条件下移取5 mL上层液体至含1%原油(取自陕北某油田)的100 mL L9培养基中，30 ℃、150 r/min条件下培养7 d. 如此转接培养5次后，将最后一次的培养液在 10 000 r/min下离心分离，加入20 mL L9洗涤混合菌5次后，获得石油烃降解菌群MC. 取5 mL MC送生工生物工程(上海)股份有限公司测序. 其余部分保存在甘油中置于冰箱-20 ℃ 保存.

1.3 石油污染土壤的修复试验方案

1.3.1生物刺激修复中最佳氮源的筛选

称取36份20 g土壤分装于36个烧杯中，分别向污染土壤中加入尿素、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、NaNO35种不同类型的氮素，设置土壤C/N为100∶10(C含量以总石油烃含量的85.1%计)，以不加入氮素的土壤为控制试验(CK)，设置土壤含水量分别为5.1%和15.1%. 每个处理设3个平行. 修复30 d时取样进行测定，根据测定结果确定适合黄绵土修复的氮素类型.

1.3.2最佳C/N的确定

称取12份20 g污染土壤分装于12个烧杯中，利用1.3.1节试验选出的最佳氮素类型，按C/N分别为100∶5、100∶10、100∶20向土壤中进行施加，以不施入氮素的土壤作为控制试验(CK)，设置土壤含水量为15.1%，修复30 d时取样测定，比较不同C/N对黄绵土中石油烃的去除效果.

1.3.3生物强化和生物刺激对污染土壤的修复效果比较

利用1.2节筛选出的MC菌群制备OD600=1.0的菌悬液〔制备方法：将保存在甘油中的MC在无菌条件下接种至50 mL灭菌的LB培养基(蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，无菌水定容至1 L，pH=7.0)中〕，在30 ℃、150 r/min条件下培养24 h，8 000 r/min下离心分离10 min，弃去上清液，使用20 mL灭菌的L9培养基洗涤，相同条件下离心分离，重复2次后，用PBS溶解获得MC菌悬液. 将获得的MC菌悬液的OD值调节为1.0(600 nm处测定)备用.

石油污染土壤的生物修复试验方案见表2. 称取18份500 g的污染土壤分装于18个花盆中，室温条件下分别向土壤中接种石油烃降解菌群MC，或者加入KNO3进行生物强化或生物刺激修复试验. 每个处理设置3个平行.

表2 石油污染土壤的生物修复试验方案

修复过程中每隔3～4 d翻动一次土壤，在第7、15、30、45、60天取样测定土壤中总石油烃含量.

1.4 测定方法

1.4.1石油烃测定方法

采用超声萃取提取土壤中的总石油烃并利用GC-FID测定[18]. 准确称取风干土样 3.000 g置于离心管中，加入正己烷和二氯甲烷(体积比为1∶1)的混合物15 mL，在超声细胞破碎仪(JY92-Ⅱ，SONICS，美国)中超声萃取10 min(萃取功率为170 W)，在4 ℃、8 000 r/min下离心15 min，用定量滤纸过滤后将提取液倒入已称重的称量瓶中，重复萃取2次. 将称量瓶放于通风橱，使提取剂挥发后加入二氯甲烷定容，采用GC-FID(PE CLARUS 680，PerkinElmer，美国)对石油烃含量进行测定.

GC-FID条件[19]：HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm). 进样口温度300 ℃，检测器温度320 ℃；进样量1 μL，无分流进样；载气N2流量1.5 mL/min；柱温设置为40 ℃，保留1 min，以10 ℃/min的速率升至290 ℃，保留5 min，最后以30 ℃/min的速率升至320 ℃，保持1 min.

1.4.2土壤微生物多样性及菌群结构的高通量测序

选择5.1%土壤含水量条件下的8个土壤样品进行高通量测序分析，即自然放置第60天(NCK)、接种降解菌强化修复第7天(NBA7)和第60天(NBA60)的土壤样品、生物刺激修复第60天的土壤样品(NBS60)；15.1%土壤含水量下放置第60天的样品(ACK)、接种降解菌生物强化修复第7天(ABA7)和修复第60天(ABA60)、生物刺激修复第60天的土壤样品(ABS60).

高通量测序分析主要步骤： ①利用OMEGA试剂盒(Omega Biotek Inc., USA)提取土壤样品的总DNA，利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量. ②利用引物341F(5′-CCCTACACGACGCT CTTCCGATCTG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA-3′)进行第一轮PCR扩增，扩增程序参照文献[20]；引入Illumina桥式PCR引物后，进行第二轮扩增. ③扩增结束后，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，对于细菌的 PCR 产物和正常扩增片段在400 bp以上的PCR产物进行纯化回收. 利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，最终上机测序浓度为20 pmol.

1.5 统计分析方法

对高通量测序结果进行处理及统计分析. 使用Prinseq软件对高通量测序结果进行质量控制，将所测序列与RDP数据库进行序列比对，使用Mothur软件按97%的相似度归类同种可操作分类单元(OTU)，计算Shannon-Wiener、Ace、Chao1、Simpson多样性指数，对测序结果进行物种分类分析.

石油烃含量为3次测定结果的平均值. 经3次平行测定，利用Excel 2010进行平均值和标准差计算，采用Originpro 9.0及Excel 2010软件制图.

2 结果与讨论

2.1 生物修复可行性分析

陕北延长地区石油污染土壤质地为黄绵土，土壤中粉粒和砂粒占比共计77.1%，其通气性能较好，可为生物修复提供较好的土壤质地条件.

研究[21-22]表明，当土壤C/N接近100∶10时，有助于土壤微生物对污染物进行降解代谢. 该研究中供试土壤总石油烃含量为 15 233 mg/kg，土壤总碳含量按总石油烃的85.1%计[23]，为 12 948 mg/kg，土壤中铵态氮和硝态氮总量为28.2 mg/kg，计算所得C/N为459∶1，远高于保持微生物活性的最佳值. 因此，向污染土壤中补充氮素以提高微生物代谢活性的修复方式理论上可行. 污染土壤的自然含水量为5.1%，文献报道的适合微生物降解污染物的土壤含水量为15.1%～30%[24]，因此需要向土壤中补充水分以促进石油烃的降解.

Abalos等[25]研究发现，当石油烃降解菌总数为108CFU/g时，对石油烃的代谢活性最强. 该研究土壤中石油烃降解菌总数为3.30×105CFU/g，低于文献[25]报道结果. 因此，理论上需要向土壤中接种降解菌进行生物强化修复处理.

通过分析土壤含水量、土壤C/N、土壤中降解菌数量，确定对接种降解菌进行生物强化修复和施入氮素进行生物刺激修复的两种修复方式.

2.2 生物强化修复

2.2.1石油烃降解菌群的筛选

从石油污染土壤中通过富集培养获得了石油烃降解菌群MC(见图1). 利用高通量测序分析石油烃降解菌群的主要组成：变形菌门(Proteobacteria，99.75%)—γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria，99.49%)—假单胞菌目(Pseudomonadales，99.36%)—莫拉氏菌科(Moraxellaceae，87.33%)—不动杆菌属(Acinetobacter，87.00%)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae，12.04%)—假单胞菌属(Pseudomonas，12.00%).

注： 图形红色部分从内到外依次为门、纲、目、科、属，颜色越深，表示占比(丰度)越大. 图1 石油烃降解菌群(MC)种群结构Fig.1 Population structures of petroleum hydrocarbon degrading flora (MC)

不动杆菌属和假单胞菌属是文献报道中常见的石油烃降解菌. Ömer等[26]、Zhang等[27]、武海杰等[28]分别从土耳其、中国上海市和新疆克拉玛依地区污染土壤中筛选出可降解石油的不动杆菌属；Pacwa-Pociniczak等[29]、任随周等[30]、曹冠楠等[31]分别从波兰、中国广东省和北京地区污染土壤中筛选出了可降解石油烃的假单胞菌属；杨茜等[32]利用Bush-hass培养基从陕北地区石油污染土壤中筛选出的石油烃降解菌主要为假单胞菌属和不动杆菌属. 这些结果都说明假单胞菌属和不动杆菌属是在不同地理区域环境中普遍存在的石油烃降解菌菌属.

2.2.2接种降解菌群MC对石油烃的去除效果

在两种不同土壤含水量(5.1%的自然含水量和15.1%含水量)条件下，向石油污染土壤中接种108CFU/g的降解菌群MC修复60 d，对石油烃的去除效果如图2所示. 结果表明，在自然含水量(5.1%)条件下修复60 d，土壤中石油烃含量由 15 233 mg/kg降至 13 617 mg/kg，去除率为10.61%(见图2中NBA曲线)，未接种降解菌群的对照组(NCK)总石油烃含量由 15 233 mg/kg降至 14 422 mg/kg，去除率为5.32%. 可见，5.1%的自然含水量条件下接入的降解菌群对土壤中石油烃起到了一定的去除作用.

在15.1%含水量条件下接种降解菌群MC修复60 d，土壤中石油烃含量由 15 233 mg/kg降至 12 511 mg/kg，去除率为17.87%(见图2中ABA曲线)，15.1%含水量条件下未接种的对照组(ACK)中总石油烃含量由 15 233 mg/kg降至 13 833 mg/kg，去除率为9.19%(见图2中ACK曲线). 相比对照组NCK与ACK，接种降解菌群MC对土壤中石油烃起到了较好的去除作用. 与5.1%的自然含水量相比，增加土壤含水量可提高菌群MC对石油烃的降解率. 总体上两种含水量条件下降解菌群对土壤中石油烃的去除效果相对较差.

图2 不同处理下土壤中石油烃的生物去除效果Fig.2 The effects of bioremediation strategy on petroleum hydrocarbon removal in the soils with different treatments

左丽敏等[33]比较了向污染土壤中接种石油烃降解菌群(优势菌为假单胞杆菌属，分别为无菌水菌悬液和LB菌悬液)对石油烃的去除效果，结果发现，经过58 d的修复，接种LB菌悬液的土壤石油烃去除率为30.2%，与接种无菌水菌悬液的土壤石油烃降解率相差不大. 这说明加入碳源、氮、磷、钾可提高石油烃污染土壤微生物的活性，促进石油烃的降解. Bento等[34]利用筛选出的石油烃降解菌群(构成为蜡状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、不动杆菌和假单胞菌)对美国长岛和中国香港两个地区的石油污染土壤进行生物强化修复，经过12周的处理，美国长岛石油污染土壤中C12～C23直链烷烃的去除率为75.2%(自然衰减率为48.7%)，C23～C40直链烷烃的去除率为72.7%(自然衰减率为45.7%)；而中国香港污染土壤中C12～C23直链烷烃的去除率为17.8%(自然衰减率为23.3%)，C23～C40直链烷烃的去除率为7.3%(自然衰减率为7.5%)，说明同一降解菌群对不同地区土壤中石油烃的去除效果差异显著. 生物强化修复的效果既受土壤质地条件的影响，也受菌群存在形式的影响. 该文筛选出的菌群MC对液相中浓度为 10 000 mg/L的石油烃降解率可达到89.28%，但是对黄绵土中石油烃的降解效率较低，仅为17.87%[35].

2.2.3生物强化降解菌群在土壤中的生长和存活

利用高通量测序研究了降解菌群MC在土壤中的生长和存活情况(见图3)，结果表明，石油污染原土壤中变形菌门的相对丰度为28.22%，γ-变形菌纲(Gammapro-teobacteria)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、不动杆菌属(Acinetobacter)的相对丰度分别为6.36%、0.33%、0.04%、0.04%；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度分别为0.29%和0.26%.

图3 接种降解菌生物强化对土著微生物菌群结构的影响Fig.3 The effects of bioaugmentation with the inoculated degrading bacteria MC on the structures of indigenous microbial flora

在5.1%和15.1%两种含水量条件下向土壤中接种MC菌群修复7 d，土壤中变形菌门相对丰度分别增至66.35%和57.98%〔见图3(a)〕，γ-变形菌纲(Gammapro-teobacteria)的相对丰度分别增至58.48%和40.69%〔见图3(b)〕，假单胞菌目(Pseudomonadales)的相对丰度分别增至56.78%和35.38%〔见图3(c)〕，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的相对丰度分别增至25.87%和30.30%；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的相对丰度分别增至30.91%和5.08%〔见图3(d)〕，不动杆菌属的相对丰度由0.04%分别增至25.86%和30.25%，假单胞菌属的相对丰度由0.26%分别增至30.87%和5.03%〔见图3(e)〕；修复60 d时，这些不同分类学上的菌种在土壤中仍保持较高的相对丰度〔见图3〕.

降解菌群MC主要分类学组成见2.2.1节和图1，在5.1%的自然含水量和15.1%含水量条件下向污染土壤中接种MC 7 d和60 d时，土壤中MC菌群优势门、纲、目、科、属的相对丰度增加明显，说明接种的降解菌群MC可在土壤中迅速生长并长期存活，且降解菌群的生长不受土壤含水量的影响.

2.2.4生物强化对土著菌群alpha多样性的影响

微生物的alpha多样性可通过丰富度和均匀度来表征. Ace指数和Chao1指数主要用于表征土壤微生物的丰富度，二者数值越大，土壤微生物的丰富度越好；Shannon-Wiener和Simpson指数主要用于表征土壤微生物群落的均匀度，Shannon-Wiener指数越大、Simpson指数越小时，土壤微生物均匀度越好[36-37].

接种降解菌群对土壤微生物多样性的影响见表3. 结果表明，5.1%的自然含水量条件下，接种降解菌群修复7 d，土壤微生物群落的Shannon-Wiener指数由7.29降至3.66， Ace指数由 11 841 降至 9 653，随修复时间的增加，Shannon-Wiener指数和Ace指数持续下降. 15.1%含水量条件下接种降解菌群的土壤微生物群落多样性指数也呈降低趋势，但降低程度低于自然含水量条件下的接种处理，说明在15.1%含水量条件下向污染土壤中接种降解菌，能较好地保持土壤微生物多样性，这与已有研究结果[38]一致.

表3 生物修复对土壤微生物多样性的影响

生物强化修复显著降低了土壤菌群的多样性，土壤中石油烃降解率最高仅为17.87%(见2.2.2节)，说明石油烃的降解作用不是依靠某些特异性降解菌的降解作用，而是依靠多种微生物的协同代谢作用，土壤微生物物种越丰富，分布越均匀，越有利于土壤污染物的去除.

2.3 生物刺激修复

2.3.1最佳氮源的确定

向污染土壤中分别施入尿素、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、NaNO35种不同类型的氮素，设置土壤C/N为100∶10下修复30 d，在5.1%的含水量条件下，5种氮素对总石油烃的去除率分别为10.41%、10.07%、9.38%、12.34%、9.17%；在15.1%的含水量条件下，5种氮素对石油烃的去除率分别为19.17%、19.72%、26.41%、24.69%、18.27%. 5.1%自然含水量和15.1%含水量条件下未施入氮素的石油烃自然降解率分别为8.07%和10.69%. 相比未经修复处理的污染土壤，施入氮素有利于石油烃的降解，且使用KNO3作为氮源对石油烃的去除效果较好〔见图4(a)〕.

图4 生物刺激修复最佳氮源和最佳C/N的确定Fig.4 The optimal nitrogen source and optimal C/N for biostimulation

2.3.2最佳C/N

使用KNO3作为氮源，比较C/N为100∶5、100∶10、100∶20时对土壤石油烃的去除效果. 当C/N为100∶20时，两种含水量条件对石油烃的去除效果均较好，其中15.1%含水量条件下加入外氮源KNO3更有利于石油烃的去除〔见图4(b)〕.

研究表明，适合石油烃降解的最佳C/N一般为100∶10[39]，该研究中测定得到的石油烃降解最佳C/N 为100∶20，该差异可能是由不同地区土壤中的微生物维持活性所需氮含量不同所致. 因此在对污染土壤进行修复时，需要结合土壤土质类型、微生物种群结构及气候条件等因素，确定所需补充的最佳氮源类型及含量.

2.3.3生物刺激修复对石油烃的去除效果

根据2.3.1节和2.3.2节所得结果，在5.1%的自然含水量条件下，利用KNO3作为最佳氮源并调节土壤C/N为100∶20对污染土壤修复60 d，总石油烃含量由 15 233 mg/kg降至 12 480 mg/kg，去除率为18.07% (见图2中NBS曲线). 在15.1%含水量条件下修复60 d，总石油烃含量由 15 233 mg/kg 降至 8 413 mg/kg，石油烃去除率为44.77%(见图2中ABS曲线). 相比接种菌进行生物强化修复(见图2中NBA和ABA曲线)，生物刺激修复对黄绵土中石油烃的去除效果更好.

2.3.4外源氮生物刺激的土壤菌群变化

经生物刺激的石油污染土壤中优势菌相对丰度如图5所示. 由图5可见，向土壤中加入KNO3进行生物刺激修复，放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度由23.40%增至36.20%～40.01%. 一些主要的石油烃降解菌属包括类诺卡氏菌属(Nocardioides，7.3%)、诺卡氏菌属(Nocardia，6.9%)、红球菌属(Rhodococcus，4.2%)的相对丰度增加明显. 另外，生物刺激修复60 d时，在5.1%和15.1%的含水量下，土壤Shannon-Wiener指数为6.14和6.18，Ace指数分别为 10 018.98 和 10 156.00 (见表3). 总体上，相比生物强化修复，生物刺激对土壤细菌群落结构组成和多样性的影响较小.

图5 外源氮生物刺激修复对土壤菌群结构的影响Fig.5 The effects of exogenous nitrogen biostimulated remediation on the structures of soil microbial flora

叶茜琼[40]研究了微生物修复对土壤菌群结构的影响，结果发现，生物强化修复处理使得土壤微生物的丰富度和均匀度均降低，微生物种类较单一. 生物刺激修复不会使土壤微生物群落结构发生明显变化，较好地维持了土壤微生态的稳定性. 该研究测定结果和文献[40]报道结果一致.

3 结论

a) 利用接种降解菌群生物强化修复陕北地区石油污染黄绵土，在15.1%的含水量条件下修复60 d，石油烃的最高去除率为17.87%；相比生物强化修复，外源氮生物刺激有利于黄绵土中石油烃的去除，15.1%含水量条件下向土壤中加入KNO3使土壤C/N为 100∶20，修复60 d时土壤中石油烃的去除率最高可达44.77%.

b) 在不同含水量条件下接种的降解菌群均可在土壤中快速生长并长期存活. 接种降解菌的土壤微生物群落多样性明显降低，Shannon-Wiener指数由6.62～7.29降至3.09～5.77，Ace指数由 11 841.83～12 059.35 降至 7 842.22～11 234.11；向污染土壤中加入外源氮进行生物刺激修复，土壤细菌Shannon-Wiener指数和Ace指数略有降低，由7.29～6.62和 11 841.83～12 059.35 分别降至6.14～6.18和 10 018.98～10 156.00. 相比生物强化修复，生物刺激修复可以维持土壤多样性不发生明显变化. 石油烃的降解作用不是依靠某些特异性降解菌的降解作用，而是依靠多种微生物的协同代谢作用，土壤微生物物种越丰富，分布越均匀，越有利于土壤污染物的去除.