凝血级联活化与大气颗粒物引发心血管疾病关联的研究进展

薛凯兵， 李志刚， 魏永杰

中国环境科学研究院， 环境基准与风险评估国家重点实验室， 北京 100012

空气污染被认为是导致心血管疾病的主要影响因素之一，并与多种心血管疾病风险相关[1]. 研究[2-6]指出，大气颗粒物是空气污染诱发不良健康效应(尤其是对心血管系统的影响)的主要原因. 流行病学研究[7-8]提示，大气颗粒物的短期、长期暴露均与缺血性心脏病、心力衰竭、缺血性/血栓性脑卒中等心血管疾病的死亡风险增加有关联. 毒理学研究[9-10]表明，大气颗粒物对心血管影响的主要生物学机制有3种：①肺部产生的促炎症或氧化应激介质溢出到全身循环；②促进自主神经系统失衡；③大气颗粒物组分直接渗透到心血管组织中发生反应. 大气颗粒物暴露后通过这3种机制介导的血液凝结被认为可能是导致心血管疾病风险增加的主要原因之一. 凝血级联活化作为机体血液凝结最基础的部分，必然参与到大气颗粒物暴露后的血液凝结过程中. 为了明确大气颗粒物对心血管疾病的作用过程，预防和最大限度地减少大气颗粒物暴露对健康的危害，有必要深入了解大气颗粒物如何诱导血液凝结. 该文综述了凝血级联活化在大气颗粒物诱导血液凝结中的关键作用，主要讨论了大气颗粒物暴露对外源性和内源性凝血级联通路的影响，以期为凝血级联活化与大气颗粒物引发心血管疾病的关联提供理论基础.

1 凝血级联在大气颗粒物促凝效应中的重要性

在高等生物体内，凝血级联被激活以形成纤维蛋白凝块来制止血管损伤后的失血. 凝血级联是指凝血因子的裂解活化并激活通路中的后续蛋白酶，逐级反应最终产生纤维蛋白的过程[11]. 在早期模型中，凝血级联反应分为外源性通路和内源性通路. 在外源性通路中，组织因子(tissue factor, TF)作为启动因子与因子Ⅶ (FⅦ)结合形成TF-Ⅶa复合物，进一步激活因子Ⅹ (FⅩ). 在内源性通路中，因子Ⅻ (FⅫ)与带负电荷的表面接触后，转化为活化的FⅫa，再依次激活因子Ⅺ、因子Ⅸ和因子Ⅹ[12]. 然后，二者汇合成共同通路，FⅩa、凝血酶原(prothrombin, FⅡ)和辅助因子Ⅴa组装成凝血酶激活剂复合物，该激活剂激活凝血酶，最终将纤维蛋白原转化为纤维蛋白[12]. 然而，随着早期模型无法解释新出现的问题，Hoffman等[11,13]重塑了凝血级联，新的凝血理论指出机体止血过程包含发生在不同细胞表面的3个重叠阶段：①凝血在携带组织因子的细胞上启动；②产生的少量凝血酶激活血小板；③凝血过程在激活的血小板表面延伸，产生大量凝血酶. 基于细胞的凝血级联理论[13]表明，内源性通路和外源性通路其实并不是两条完全独立的凝血路径，二者同时在不同的细胞表面平行运行，因此血液正常流动平衡过程涉及多种循环血细胞、各种凝血因子、血小板、纤维蛋白溶解因子、血管壁以及内皮细胞衍生介质之间的相互作用. 研究[14-16]表明，大气颗粒物暴露会影响这些保持血液正常流动平衡的各种因子，进而打破机体血液流动平衡. 已有研究中大气颗粒物暴露后主要影响的凝血蛋白或指标如表1所示，具体包括：①凝血因子表达变化，如TF[14-19]、凝血酶(thrombin，FⅡa)[20]、FⅩa[19]、纤维蛋白原(fibrinogen，FⅠ)表达增加[21-24]，FⅧ、FⅩ、FⅡ活性增加[20]以及组织因子通路抑制剂(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)表达减少[25]. ②纤维蛋白溶解调控蛋白表达变化，如组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)表达减少[26-28]，纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)表达增加[29-30]. ③血小板活化标志物表达增加，包括可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40)[31-33]、可溶性P选择素(soluble P-selectin，CD62p)[34-35]和血管性假血友病因子(von willebrand factor，vWF)[29]. 该文归纳了大气颗粒物暴露诱发的凝血效应，主要包括凝血结形成、纤维蛋白溶解抑制和血小板活化，且这3种凝血效应均与凝血级联活化有关[36]. 凝血级联是凝血结形成的一个组成部分. 大气颗粒物暴露诱导凝血因子表达增加，通过凝血级联反应生成纤维蛋白，纤维蛋白集聚，从而形成凝血结. 纤维蛋白溶解主要受组织纤溶酶原激活物调控. 大气颗粒物暴露后，通过凝血级联反应诱导生成的凝血酶能够促进纤溶酶原激活物抑制剂表达的增加，进而抑制了纤维蛋白溶解[36]. 此外，大气颗粒物暴露后通过凝血级联产生的凝血酶可以促进血小板聚集，使血小板活化. 综上，凝血级联的活化在大气颗粒物暴露诱导的血液凝结中可能发挥了关键作用，从而与大气颗粒物暴露后心血管疾病的发病密切相关.

表1 大气颗粒物暴露诱发的凝血效应

凝血级联活化在大气颗粒物暴露诱导血液凝结中发挥关键作用，因此有必要探究大气颗粒物暴露对凝血级联活化的影响. 区分大气颗粒物暴露激活的凝血级联与人体正常止血过程中凝血级联活化过程的异同，明确大气颗粒物暴露激活凝血级联反应的机制，是亟待厘清的科学问题.

2 PM暴露对凝血级联通路的影响

目前，科学家们已经开展了一些关于大气颗粒物暴露激活凝血级联的研究，该文综述了大气颗粒物暴露对外源性或内源性凝血级联通路的影响.

2.1 PM暴露对外源性凝血通路的影响

TF作为外源性通路的启动因子，成为首要的研究对象. 在健康的机体中，TF在器官和体表的血管周围细胞和上皮细胞内表达. 内皮屏障的破坏使血管外TF暴露于血液中，进而激活凝血通路[37]. 然而，体内和体外研究均表明，大气颗粒物暴露也会增加TF的表达，进而激活外源性凝血通路[17-18]. 暴露于PM2.5后，小鼠血液中TF和凝血因子FⅩ的水平均明显升高，并在肺组织中观察到纤维蛋白沉积[19]. 近期研究[16]发现，纳米级颗粒暴露导致内皮细胞中调控凝血级联反应的蛋白(TF和t-PA)表达异常，产生促凝效应. 研究已经明确大气颗粒物暴露诱导TF表达上调，但介导TF表达增加的机制尚不清楚.

作为大气颗粒物对心血管系统损害的主要机制，炎症反应也是大气颗粒物暴露后产生促凝效应的关键原因. 炎症反应对外源性凝血级联通路活化的贡献在于各种炎性因子可诱导内皮细胞和血细胞表达TF[38]. Seaton等[39]在1995年假设大气颗粒物污染与心肺疾病高危人群死亡的关联可能是由沉积在肺泡中的超细颗粒引发肺泡炎症，从而激活凝血级联所致. 直到2005年，Gilmour等[40]证实了这一假说的可能性，其发现可吸入颗粒物暴露后巨噬细胞中炎症因子白细胞介素-8和TF的表达均增加，从而激活了外源性凝血通路，显著缩短了凝血时间. 研究[40]认为，大气颗粒物暴露会引起炎症，促成外源性凝血通路的活化. 近期研究[16,19]表明，PM2.5可引发炎症反应进而激活TF调控的外源性凝血级联，从而诱导血液凝结. Liang等[19]研究发现，暴露于PM2.5后，小鼠血液中促炎因子和黏附分子白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β、CRP、TF和凝血因子FⅩ的表达水平均明显升高，并在肺组织中观察到纤维蛋白沉积. Li等[16]研究表明，空气中的纳米级颗粒可通过活性氧诱导的炎症激活内皮细胞，并进一步导致参与凝血级联的凝血相关蛋白(TF和t-PA)表达的异常. 在众多可能诱发大气颗粒物促凝效应的炎症反应物种中，对炎症因子IL-6的研究较多. Mutlu等[20]研究发现，敲除IL-6基因的小鼠可免受可吸入颗粒物诱导的血管内凝血酶的形成以及动脉血栓形成加速的影响，证实小鼠暴露于可吸入颗粒物后促血栓状态的形成需要肺泡巨噬细胞释放IL-6. 此外，有研究[41]指出，IL-6的促凝机制包括增加促凝蛋白(包括FⅠ、TF、FⅧ和von Willebrand因子)的转录表达以及减少抗凝蛋白(蛋白S和抗凝血酶)的转录.

然而，TF抗原的测定并不一定能反映TF的功能和反应活性，因为血液中存在微量的血源性TF[42-43]. 血源性TF由细胞活化和凋亡脱落形成的微泡(microparticles，MPs)所携带[44]. MPs因包含磷脂表面和携带促凝蛋白TF具有极高促凝活性[45]. 磷脂表面可为凝血酶激活复合物的组装提供条件[46]. 健康捐献者血液中的血源性TF水平极低，而在各种疾病患者中血源性TF水平升高[47]. 此外，部分血源性TF的非活性前体在受到刺激后发生构象变化，使TF与活化的FⅦ结合并激活FⅩ[48]. 鉴于此，科学家探索了大气颗粒物的促凝效应与循环MPs的关联性. Vermylen等[49]于2006年提出吸入空气污染物可能会诱导骨髓中携带TF的造血细胞进入血液循环系统. Bonzini等[50]研究发现，高浓度大气颗粒物暴露会导致凝血酶原时间缩短、内源性凝血酶生成潜能增加，但凝血和纤溶标志物无显著变化. 笔者推测循环血小板活化单核细胞产生的MPs可能介导了这种凝血效应. 此外，有研究[51]指出，在非吸烟的糖尿病患者中，机体循环MPs的增加与大气颗粒物暴露有关. 同时，富含MP的血浆中纤维蛋白原和凝血酶的升高也与大气颗粒物暴露有关. 近期研究[52]证实，单核细胞和内皮细胞暴露于大气颗粒物后，可增加MPs的产生. 这些MPs携带具有功能活性的TF，因此可以触发外源性凝血级联通路的活化，从而导致血栓性疾病. 因此，大气颗粒物暴露后MP数量和促凝血潜能的增加可能是诱导凝血效应的原因之一.

综上，大气颗粒物暴露可以诱导血液中TF含量的增加，进而活化外源性凝血级联通路. TF增加的机制主要包括炎症反应介导的TF表达，以及源自循环MPs的血源性TF的增加. 但相关研究仍需从以下几个方面加强：①目前外源性通路的活化主要根据大气颗粒物暴露后TF的上调来推测，已有研究鲜有关注凝血通路中所有凝血因子的变化以及凝血因子之间的调控关系，尚未确切证实大气颗粒物暴露后外源性凝血通路的活化. ②多数研究表明，炎症反应可能介导了大气颗粒物暴露后TF表达的增加，但TF的来源和完整的炎症调控机制尚不清楚. 深入探索炎症反应介导凝血级联活化的机制有助于干预大气颗粒物引发的心血管疾病. ③为明确大气颗粒物暴露激活外源性凝血级联通路的机制，仍需探索炎症反应介导的TF表达与血源性TF增加对激活外源性凝血级联通路的贡献.

2.2 PM暴露对内源性凝血通路的影响

传统理论认为，外源性凝血通路在机体的止血平衡中起主要作用[53]. 然而，FⅦ激活FⅨ以及FⅠa激活FⅪ的认识打破了原有的止血理论[54-55]. 在机体的止血平衡中，外源性通路和内源性通路并非完全独立. 但FⅫ作为机体内源性通路的启动因子，其作用仍存在争论[56]，主要原因有2个：① FⅫ的先天性缺乏与人类或小鼠的出血无关；②体内缺乏合适的表面来支持FⅫ的活化[57]. 最初认为FⅫ激活内源性凝血通路可以由人工表面(如玻璃、高岭土、碳酸钡等)介导[58]，但一些天然或生理表面，如血小板聚磷酸盐、错误折叠的蛋白质和胶原蛋白等，也被证实支持FⅫ的活化[59]. 研究[60-62]表明，包含复杂成分的大气颗粒物同样能够接触激活FⅫ，进而激活内源性凝血通路产生凝血效应.

与外源性通路相比，大气颗粒物暴露对内源性凝血级联通路的影响研究起步较晚. Kilinc等[60]于2011年报道了FⅫ和内源性激活通路在大气颗粒物持续促凝反应中的作用. 与正常血浆比，体外暴露于大气超细颗粒物的人先天性FⅫ缺陷血浆的凝血酶生成潜能被抑制，气管内灌注大气超细颗粒物的FⅫ基因敲除(FⅫ-/-)小鼠血浆的凝血酶生成潜能同样受到抑制，表明人类长期暴露于大气超细颗粒物后血液凝结风险的增加可能与FⅫ调控的凝血酶形成有关[60]. 一项更有说服力的研究[61]表明，高浓度大气细颗粒物通过激活激肽释放酶激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)来调节内源性的凝血通路，具体为KKS的初始因子FⅫ与大气颗粒物样品的结合实现了FⅫ的自我活化，使血浆激肽前体(plasma prekallikrein，PPK)转化为血浆激肽(plasma kallikrein，PK)，然后裂解高分子量激肽原(high molecular-weight kininogen, HK)，释放出具有生物活性的多肽缓激肽. PK对FⅫ的激活产生正反馈调节作用，从而放大KKS系统的激活作用[63]. 大量FⅫa会将FⅪ活化，从而引发一系列级联反应事件，最终导致凝血酶生成. 此外，Wang等[62]进一步证实了KKS系统在大气细颗粒物诱导内源性凝血系统活化中的作用. 大气细颗粒物暴露后，PK基因敲除小鼠血浆中凝血酶-抗凝血酶复合物的水平以及凝血酶生成潜势均较正常小鼠显著降低；同时，添加前激肽释放酶抗体可消除PM2.5诱导的正常人血浆中凝血酶的生成[63]. 综上，大气细颗粒物能激活KKS系统进而活化内源性凝血通路，介导凝血酶生成. 目前大气颗粒物对内源性凝血通路的影响研究尚有不足，在未来流行病学和毒理学研究中需侧重关注大气颗粒物暴露诱导机体FⅫ和FⅫa的表达变化，以期更全面地掌握大气颗粒物对内源性凝血路径的影响.

上述研究多是基于大气颗粒物处理后的离体试验或体外试验. 这些研究的基础是假设血液循环中存在大气颗粒物，对于大气颗粒物是否进入血液以及哪些组分诱导了血液凝结效应，科学家们一直在不断探索. Nemmar等[64]证明，作为空气超细颗粒的替代品，小鼠气管内灌注的放射性标记白蛋白纳米胶体颗粒能迅速从肺部扩散到全身循环. 近期有研究[65]发现，金纳米颗粒可以进入人和小鼠的血液循环系统. 尽管是超细颗粒的替代品，这些颗粒在体内的可观察性表明,大气颗粒物可能进入血液. 在未来研究中，深入探索大气颗粒物在血液中的迁移情况是非常有必要的. 此外，目前仅有个别研究探讨大气颗粒物中单个组分对FⅫ的激活作用. Jin等[61]研究发现，带负电荷的二氧化硅颗粒和脂多糖处理可导致血浆激肽释放酶的形成，并证实大气颗粒物中的颗粒态物质和内毒素是诱导KKS活化的原因. Mutch等[66]研究发现，固定化的Ni2 +和Cu2 +以高亲和力结合FⅫ、FⅪ和HK，从而刺激KKS的活化，激活FⅫ介导的凝血通路. 大气颗粒物中包含的过渡金属对内源性通路的活化可能是大气颗粒物暴露激活内源性凝血通路的机制之一.

研究大气颗粒物暴露对内源性凝血级联通路的影响，不仅有助于全面理解大气颗粒物暴露对凝血级联通路的影响，也为研究FⅫ介导的内源性凝血通路在健康机体中的作用提供了契机. 目前体外和体内研究表明，大气颗粒物暴露激活FⅫ，然后通过KKS系统放大信号，进而激活内源性凝血级联通路，从而调控下游凝血酶形成；同时，内源性凝血通路研究[67]发现，FⅫ的缺失与人类和动物止血异常无关，但在动脉损伤模型中FⅫ的缺失会损害闭塞性血栓的形成. 抑制FⅫ是一项可选择且安全的预防脑卒中和其他血栓栓塞性疾病的策略[68]. 根据大气颗粒物暴露研究和内源性凝血通路研究的结论，笔者推测 FⅫ 诱导的内源性凝血通路的活化在大气颗粒物诱发血栓类心血管疾病中发挥作用. 在今后的研究中，大气颗粒物引发心血管疾病发病风险在FⅫ缺乏人群与正常人群之间的区别值得关注. 研究敲除FⅫ基因或 FⅫ 表达抑制对大气颗粒物调控内源性凝血级联通路的影响,可为未来卫生干预措施提供依据.

3 结论与展望

a) 血液凝结是大气颗粒物暴露引发心血管疾病的重要机制. 大气颗粒物暴露诱发的凝血效应包括凝血结形成、纤维蛋白溶解抑制及血小板活化，三者均与凝血级联密切相关. 因此，阐明大气颗粒物暴露诱发凝血级联活化机制有助于理解凝血效应的产生，进而为未来干预大气颗粒物引发的心血管疾病提供基础.

b) 大气颗粒物暴露可激活凝血级联通路. 对外源性路径的影响主要表现为大气颗粒物诱导起始因子TF表达上调，其主要机制包括炎性反应介导的TF表达增加以及源自循环MPs的血源性TF增加. 对内源性路径的影响主要表现为大气颗粒物接触激活起始因子FⅫ，活化KKS系统，促进凝血酶生成.

c) 尽管已有证据表明大气颗粒物暴露诱发凝血级联活化，但相关研究仍需从以下几个方面加强：①目前多数研究指出，大气颗粒物暴露后，外源性或内源性凝血级联通路中少数凝血因子上调，尚需对凝血级联通路上所有凝血因子分析并展开级联调控关系验证. ②大气颗粒物暴露诱发的凝血级联是否与正常机体的凝血级联有所区别，外源性通路与内源性通路之间是否存在联系，均有待分析研究. ③目前研究结果主要来自动物暴露模型、细胞暴露模型以及体外试验，而大气颗粒物暴露诱发凝血因子表达变化的人群流行病学研究仍需加强.