1,2,5,6-四溴环辛烷(TBCO)的分析方法、环境行为及毒性效应研究进展

杨恩泰, 温 蓓*, 黄红林, 张淑贞，2

1.中国科学院生态环境研究中心, 环境化学与生态毒理学国家重点实验室, 北京 100085 2.中国科学院大学, 北京 100049

1,2,5,6-四溴环辛烷(TBCO, CAS No. 3194-57-8)，是Albemarle公司销售的一种主要用于纺织品、涂料和塑料的添加型脂环族溴代阻燃剂，其商标名为Saytex BCL-48[1]. 目前没有确定的TBCO年产量信息，2009年统计发现每年有多达10吨TBCO进口到加拿大[2]. 截至2012年，含有TBCO的产品目前正由中国、欧洲各国和(或)美国的许多公司生产或供应[3]. 虽然TBCO的热稳定性不符合生产挤压聚苯乙烯泡沫塑料(extruded polystyrene，XPS)的操作温度要求，但可用于可膨胀聚苯乙烯泡沫塑料(expandable polystyrene，EPS)和目前添加HBCD的其他材料[4]. 随着HBCD的禁止生产和限制使用，TBCO将成为潜在替代品[5]，其生产和使用量可能会上升. 作为替代品，有必要全面评估其环境行为和生物效应. 目前有关TBCO的少量研究报道显示，TBCO存在于空气[6-10]、土壤和沉积物[8,11]等环境介质中，可以在生物体内富集[1,11-13]并降解[14]. 2003年英国环境部的科学小组对TBCO可能造成的环境影响进行了评估，发现TBCO具有显著的环境持久性和生物蓄积潜能，符合欧盟关于潜在水生生物危害品的标准. 该评估报告将TBCO确定为优先进行特定物质审查的对象[15]. 已有研究表明，TBCO具有内分泌干扰毒性[4,16-17]和生殖发育毒性[4,13]. 该研究综述了TBCO的分析方法、环境行为和毒性效应的最新研究进展，并提出今后有待深入研究的方向，以期为TBCO等新型溴代阻燃剂的环境风险评估与环境管理提供科学依据.

注： 虚线表示镜像平面.图1 TBCO异构体和对映体的化学结构式Fig.1 Structures of TBCO diastereomers and enantiomers

1 TBCO的结构和理化性质

有机污染物的理化性质是决定其环境行为的首要因素，而理化性质由其化学结构所决定. TBCO的分子式为C8H12Br4，分子量为427.8，其有两个异构体，分别为α-TBCO和β-TBCO. 商用TBCO是包含 α-TBCO 和β-TBCO的混合物，其中α-TBCO约占34%，β-TBCO约占66%[2]. β-TBCO有一对对映体(见图1)，其商业品为外消旋体(EFs=0.5)[18]. Wong等[14]报道β-TBCO标准品的EFs为0.499±0.002. 在123 ℃时，α-TBCO有向β-TBCO转化的趋势，二者达到热平衡时比例分别约为15%和85%. TBCO是疏水性有机物，其水溶解度为69.2 μg/L，正辛醇-水分配系数(lgKOW)为5.24(25 ℃)，饱和蒸气压为9.43×10-3(21 ℃)[19].

2 TBCO的分析方法

环境样品中TBCO的前处理技术与HBCD等传统溴代阻燃剂类似，仪器分析一般采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS). 关于TBCO异构体和对映体的测定还没有建立国际公认的标准分析方法.

2.1 环境样品中TBCO的前处理技术

环境样品中污染物的前处理技术在整个分析过程中具有至关重要的作用. 前处理包括样品的制备、提取和净化等步骤. 环境样品中TBCO的提取方法与HBCD等传统溴代阻燃剂类似，主要包括振荡提取[20-21]、索氏提取[22-26]、加速溶剂萃取[27-28]、超声萃取[29-30]和液液萃取[31]. Wong等[14]采用索氏提取法，以二氯甲烷为溶剂成功提取了人工污染土壤中的β-TBCO，回收率大于80%；Hong等[8]以正己烷和丙酮(体积比为1∶1)为溶剂，索氏提取法测定了我国北方某电子垃圾回收站的土壤和粉尘样品中的TBCO，回收率为74%～103%. 加速溶剂萃取是在高温(50～200 ℃)和高压(10.3～20.6 MPa)下，利用溶剂高效、快速地萃取固体或半固体样品中目标物质的方法. Gauthier等[1]和Saunders等[4]均采用加速溶剂萃取法，用正己烷和二氯甲烷(体积比为1∶1)做提取剂，分别测定了银鸥蛋和青鳉组织中的TBCO，消耗溶剂在30 mL以内，提取过程耗时仅10 min，大大减少了提取剂用量并且缩短了分析时间，其回收率大于85%. 虽然加速溶剂萃取法有许多优点，但由于仪器昂贵，使用成本较大，目前尚未得到广泛应用. Gustavsson等[32]比较了不同固相萃取柱对水中TBCO萃取效率的影响，发现使用Oasis HLB(由二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮按一定比例聚合成的大孔共聚物)作为吸附剂，用二氯甲烷以及体积比为1∶1的丙酮和正己烷溶液洗脱的回收率最高.

环境样品组成十分复杂，提取的样品往往包含有机杂质或其他干扰物，样品的净化是不可缺少的步骤. 环境样品中HBCD等传统溴代阻燃剂常用的净化方法有柱层析法、浓硫酸酸化和凝胶渗透色谱法(GPC)[20-21,33]. TBCO常用的净化柱填料为硅胶[8,11,34]、弗罗里硅藻土[6,10]、氧化铝[4,14,32]等，其中复合硅胶柱可根据样品的实际情况选择填料的种类、比例和容量，是使用频率最多的净化柱. 测定沉积物样品中的TBCO时，加入盐酸活化的铜粉可以达到除硫的目的[11]. 生物样品(如鸟蛋[1]、鱼类组织[11])在固相萃取前过GPC柱(凝胶渗透色谱柱)可以除去脂肪、蛋白质等生物大分子干扰物.

2.2 仪器分析方法

HBCD等传统溴代阻燃剂的测定通常采用GC-MS[35-36]和LC-MS(液相色谱-质谱联用仪)[37-38]. TBCO具有沸点较低、易气化的特点，适合采用GC-MS或GC-MS/MS(气相色谱-二级质谱联用仪)，使用电子捕获负化学电离源(ECNI源)[1,6,8,14,34]或电子轰击电离源(EI源)[2,4,13]进行测定，也有少量用LC-MS/MS(液相色谱-二级质谱联用仪)进行分析的报道[39]. 环境样品中TBCO的分析方法见表1. Riddell等[2]在用GC-MS进行分析时发现，当进样口温度大于200 ℃时，两种异构体会发生相互的热转化，因而难以实现二者的定量检测；当使用30 m DB-5 气相色谱柱进行分离时，两种异构体迅速发生柱上转化，导致二者的色谱峰变宽，亦无法实现异构体的定量检测. 设置较低的进样口温度和使用短的色谱柱(≤15 m)是成功进行TBCO异构体定量检测的关键. Wong等[14]采用BGB-176MS(15 m×0.25 mm×0.18 μm)气相色谱柱实现了β-TBCO对映体的成功分离. Zhao等[10]使用高分辨气相色谱-高分辨质谱(HRGC-HRMS)和手性色谱柱MEGA-176 MS(10 m×0.25 mm×0.18 μm)测定了南极大气中β-TBCO对映体单体的含量. 需要指出的是，由于缺乏TBCO对映体单体的标准品和同位素标准品，对映体的定量检测存在一定的不确定性.

表1 环境介质和生物体中TBCO的分析方法

TBCO异构体可能在气相色谱进样口热转化，如果能建立LC-MS或LC-MS/MS分析TBCO异构体的方法，将有可能彻底解决这个问题. Riddell等[2]尝试用LC-MS测定TBCO，使用BEH C18(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)色谱柱分离TBCO异构体，并比较了电喷雾电离源(ESI)、大气压化学电离源(APCI)和大气压光电离源(APPI)3种离子源的检测效果，发现3种离子源均无法提供足够检测的特异性分子离子，APPI可产生大量的Br-，从而可以在m/z为79和89下进行质谱检测. Zhou等[39]建立了LC-MS/MS分析地表水中TBCO异构体的方法，通过比较C18、C8、CN和联苯类等不同填料的反相色谱柱、填料的不同粒径(5.0、3.0和1.8 μm)、不同的流动相(甲醇、乙腈、丙酮和四氢呋喃)类型及其比例对异构体分离效果的影响，发现选用填料内径为1.8 μm的C18色谱柱，流动相为水、乙腈、丙酮(其体积比为45∶30∶25)，柱温30 ℃时可以实现α-TBCO和β-TBCO异构体的有效分离. 然而无论用哪种离子源均检测不到TBCO特异性的分子离子，只能依赖于检测Br的信号进行定量. 当使用APCI离子源时，仪器检测限(IDLs)为30 pg，当使用APPI离子源时，IDLs为500 pg(进样体积2 μL). 与ESI、APPI离子源相比，使用APCI离子源的重复性最好，其变异系数小于7.2%. 总之，与GC-MS/MS相比，LC-MS/MS对TBCO的检测方法还很不成熟，能否应用于复杂环境样品的测定还是未知数.

3 TBCO的环境行为

TBCO和HBCD一样，主要通过掺杂的方式添加到产品中[41-42]. 由于缺乏化学键的束缚，TBCO可能从产品中释放，从而进入到大气环境中，或在生产、运输、回收处置过程中进入大气、土壤和水体中[43]. 大气、土壤和水体中的TBCO会被生物吸收，进入食物链并产生累积. 截至目前，TBCO已在空气和粉尘[6-10]、土壤和沉积物等环境样品[8,11]以及生物体中[1,11-12]被检出. TBCO可以在生物体内富集[11,13]并被转化[14].

3.1 TBCO的环境分布、环境持久性与长距离迁移性

与HBCD相比[44-47]，TBCO在环境中的存在水平、迁移转化及最终归趋研究非常有限. 20世纪90年代，Zitko用薄层色谱法在聚苯乙烯泡沫塑料中检测到少量的TBCO[48]，随后在很多国家的室内粉尘和室外空气中都检测到了TBCO. 例如，Dodson等[6]分析了加州北部家庭收集的粉尘，检测到TBCO最大含量为2 ng/g. 从加拿大多伦多市收集的家庭粉尘中检测到α-TBCO含量范围为1.76～112.5 ng/g，平均值为56.7 ng/g；β-TBCO的含量范围为31.3～31.75 ng/g，平均值为31.5 ng/g[9]. Hong等[8]在中国北方某电子垃圾站的土壤〔<0.049 3～0.089 0 ng/g(以干质量计)〕、空气(0.030 0 ng/m3)和粉尘(7.38 ng/g)中均检测到TBCO，其中α-TBCO在土壤、空气和粉尘样品中分别占38.9%、5.98%和26.2%. 这些比例与Riddell等[2]使用1H NMR分析商业品中α-TBCO单体的含量(34%)明显不同，表明环境中TBCO异构体可能存在不同的界面迁移、转化行为. TBCO在环境介质和生物体中的分布见表2.

表2 TBCO在环境介质和生物体中的分布

TBCO是否存在环境持久性及长距离迁移能力目前尚存争议. 2003年欧洲环境署科学小组的研究报告[15]指出，TBCO符合欧盟的vPvB(very persistent, very bioaccumulative, 显著的持久性和生物累积性)筛选标准，即在海水中及淡水中的半衰期大于60 d，在海洋及淡水沉积物中半衰期大于180 d. 但Kuramochi等[19]使用EPI(评估程序界面)组件估算了TBCO在空气(38.39 h)、水(900 h)和土壤(1 800 h)中的半衰期，并使用经济合作与发展组织的Pov和LRTP筛选工具计算了TBCO在环境中的持久性和远距离迁移潜力，结果显示TBCO具有低持久性和低长距离迁移潜力，容易发生降解转化. 以上报道均基于模型计算，但计算结果并不相同. 物理化学性质及生物富集降解特性的计算结果还需要通过实际测量来进一步确定. Sühring等[11]在德国湾、易北河的淡水和海洋采样站的沉积物中发现较高浓度的TBCO. 鉴于TBCO的挥发性较小，底泥中的TBCO不太可能来源于大气沉降，而可能来源于来往运输船只的喷涂材料，或者附近城镇的使用释放. Zhao等[10]在2011—2018年于南极洲西部收集的气态和颗粒物样品中检测到TBCO，浓度范围为ND～0.21 pg/m3，并通过手性对映体分析发现，β-TBCO的EF在0.281～0.795之间，平均值(0.568±0.099 5)和中位数(0.578)均大于0.5，该EF值与商业外消旋标准有显著差异(P<0.01)，表明在南极大气中，β-TBCO以非外消旋体的形式存在. 海水-空气交换和排放源地区存在非外消旋体残留可能是造成这种现象的原因，这为TBCO的远距离大气传输提供了证据.

综上，相对于HBCD等传统溴代阻燃剂，对TBCO环境分布及污染水平少量报道主要集中于空气和粉尘样品. TBCO是否有环境持久性、长距离传输能力尚无定论. 建议进行更广泛的研究，特别关注一些特定区域，如生产厂周边地区、垃圾拆解、堆放地等. 同时，有必要从异构体和对映体水平深入地探讨TBCO在各环境介质中的分布及界面传输过程.

3.2 TBCO的生物富集与转化

环境介质中的污染物会通过各种途径进入生物体. HBCD等传统溴代阻燃剂不仅在各环境介质中被检测到，甚至在生物体和人体组织中也发现其身影[50-53]. 迄今为止，TBCO在生物体内水平的报道主要集中于水生生物. 2009年Gauthier等[1]在北美五大湖的水鸟银鸥(Larusargentatus)蛋中发现了TBCO. Sühring等[11]在德国湾2个采样点的黄盖鲽(Limandalimanda)中检测到TBCO〔最高为12 ng/g(以湿质量计)〕. Kurt-Karakus等[12]首次报道了五大湖的水生生物体中的TBCO. TBCO在湖红点鲑鱼(Salvelinusnamaycush)中的平均值为0.173 ng/g(以干质量计)，在新虾虎鱼(Neogobiusmelanostomus)中的平均值为0.447 ng/g(以干质量计).

欧洲食品安全局(EFSA)食物链污染小组认为TBCO具有较高的生物累积潜力[54]. Sühring等[11]计算了TBCO的生物沉积物富集因子(BSAFs=2.9)，发现其接近于已知的持久性生物有机污染物BDE-47(2,2′,4,4′-四溴联苯醚)(BSAFs=3.4)和BDE-100(2,2′,4,4′,6-五溴联苯醚)(BSAFs=3.3). Sun等[13]为了评估TBCO对水生生物的潜在毒理学风险，将日本青鳉(Oryziaslatipes)胚胎暴露于TBCO中，发现TBCO在胚胎中的累积速率常数为1.7～1.8 d-1，生物富集因子最高达到1.3×104，显著大于HBCD，并将其归因于TBCO具有更少的溴原子和更小的分子直径.

HBCD等传统溴代阻燃剂可以在环境中发生降解转化[55]. 研究[55-60]表明，HBCDs工业品在环境中存在异构体、对映体选择性的环境转化、生物累积和代谢行为. TBCO和HBCD具有相似的包含异构体和对映体的脂环结构. Wong等[14]研究了β-TBCO在土壤中微生物作用下对映体分数的变化，发现在试验的前90 d，β-TBCO的对映体分数从0.502增至0.537，在第98天EF值降至0.465，表明土壤中β-TBCO的降解具有对映体选择性，并指出这种选择性可能来源于土壤微生物群落的变化. 相对于HBCD等传统溴代阻燃剂，在异构体和对映体水平对TBCO的生物富集、降解转化的研究相对匮乏，是今后需要重点加强的方向.

4 TBCO的毒性效应

研究表明，HBCD具有甲状腺毒性、神经毒性、内分泌干扰毒性、生殖发育毒性等毒性效应[61-63]，且其神经毒性具有异构体依赖性[64]. TBCO的毒性效应研究刚刚起步，且均基于TBCO总量的研究. QSAR(定量构效关系)模型预测TBCO的LC50(半致死浓度)小于1 mg/L，因此TBCO被列为潜在的水生生物急性毒物[15]. 2003年英国环境部科学小组的一项评估报告中，将TBCO归类为临界量较低的化学品，并将其确定为优先审查的对象[15]. 少量研究结果表明,TBCO具有内分泌干扰毒性[4,16-17]、生殖发育毒性[4,13]和神经毒性[64].

4.1 内分泌干扰毒性

Saunders等[17]应用体外试验研究了TBCO的内分泌干扰潜能. 酵母雌激素/雄激素筛查试验(YES/YAS)表明TBCO是雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)拮抗剂，且对ER的拮抗作用较弱，但对AR的拮抗作用呈剂量依赖性. 与二氢睪酮(DHT)对照相比，暴露于300 mg/L TBCO的抑制率为74%. 将H295R细胞暴露于TBCO后，睾酮(T)的浓度显著下降，而17β-雌二醇(E2)的浓度显著升高且呈剂量依赖性，15 mg/L TBCO的暴露会导致H295R细胞中17β-雌二醇(E2)的浓度增加3.3倍. Mankidy等[16]发现TBCO的暴露会导致猪初级睾丸细胞中睾酮(T)和雌二醇(E2)的合成增加. 3 mg/L TBCO的暴露会导致睾酮产生量增加2.1倍，0.03 mg/L TBCO的暴露会导致胞内E2的浓度增加5.9倍. 这可能是由于TBCO通过调控CYP17A1基因，影响甾体生成路径，使类固醇生成酶的表达水平升高. Saunders等[4]将雄性和雌性青鳉(Oryziaslatipes)的性腺暴露于较高浓度的TBCO中，发现类固醇生成、胆固醇代谢和调节反馈机制相关的基因表达下调，证实了TBCO具有内分泌干扰效应.

4.2 生殖发育毒性

Saunders等[4]给青鳉投喂含有58 μg/g(以湿质量计)TBCO的食物，暴露21 d后，发现青鳉累计生殖力减少了18%，并检测到下丘脑-垂体-性腺-肝脏(HPGL)轴的关键调节基因表达改变. 雌青鳉肝脏中多个基因转录产物的丰度发生改变，并与卵黄产生有关，这可能是导致生殖能力减少的原因. Sun等[13]将受精后2 h至孵化后1 d的日本青鳉胚胎暴露于不同浓度的TBCO中，发现TBCO会导致日本青鳉的胚胎孵化天数呈浓度依赖性增加以及孵化成功率显著降低. 转录产物分析和背景颜色分析表明，在发育早期暴露于TBCO可能通过抑制眼睛发育和功能所需基因的表达而损害视力. Sun等[13]发现TBCO对心血管系统发育和功能的重要蛋白丰度有所影响，并通过心率量化发现胚胎心率显著减慢；青鳉生命早期阶段(ELS)的心脏功能会受到TBCO的损害，证明了TBCO对心血管系统发育的损害. 转录组学和蛋白质组学分析表明，TBCO会损害有关胚胎发育的蛋白质合成. TBCO有可能通过减少调节卵母细胞减数分裂的蛋白，抑制卵母细胞的减数分裂，干扰卵母细胞发育，从而导致生殖力下降. Van-Essen等[65]将斑马鱼(Daniorerio)胚胎暴露于TBCO，发现其死亡率呈浓度依赖性增加和心率降低. 暴露于TBCO也以浓度依赖的方式增加了斑马鱼脊柱弯曲和未膨胀鱼鳔的发生率. 然而，暴露于TBCO的胚胎中，脂质过氧化和对氧化应激反应重要基因的mRNA丰度都没有增大，这表明这些效应不是由氧化应激引起的. 细胞色素p4501a的mRNA丰度并不高，这表明该效应不是由激活芳基碳氢化合物受体引起的. 此外，TBCO对鱼鳔发育和膨胀重要基因的mRNA丰度无影响. 总之，TBCO对斑马鱼的早期生命阶段造成不良影响，但其作用机制有待进一步研究.

4.3 神经毒性

已有研究[66-67]表明HBCD具有神经毒性效应，可通过内源性途径诱导神经细胞发生凋亡. Shi等[64]比较了HBCD和TBCO对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 的毒性差异,结果显示，HBCD和TBCO均诱导细胞毒性，包括剂量依赖性的细胞活力下降、细胞膜通透性增加、细胞骨架发育损坏以及明显的细胞凋亡，HBCD的毒性大于TBCO. 通过检测与细胞凋亡有关的几种蛋白质(Caspase-3、caspase-9和Cyt c)的表达水平，指出线粒体凋亡路径可能是引起神经毒性的机理之一. 为了进一步认识HBCD和TBCO毒性反应的机理，Shi等[64]检测了细胞内ROS(活性氧)和Ca2+水平,结果表明，HBCD和TBCO处理后的细胞内ROS水平显著上升，TBCO处理的细胞内ROS水平远低于HBCD处理组，并且TBCO诱导的线粒体超氧化物未见明显变化. Shi等[64]也发现,HBCD和TBCO处理组细胞内Ca2+水平显著升高，TBCO处理组细胞内Ca2+水平远高于HBCD处理组，在Ca2+抑制剂BAPTA-AM存在时，HBCD和TBCO诱导的细胞毒性均显著降低. 这表明ROS的产生和Ca2+稳态失衡都是HBCD和TBCO细胞毒性的机制，而与HBCD相比，在TBCO诱导细胞毒性中Ca2+介导的凋亡比ROS的产生起着更重要的作用.

5 结论与展望

a) 与HBCD等传统的溴代阻燃剂相比，TBCO的研究还不完善. 环境样品中TBCO的前处理技术与HBCD等传统溴代阻燃剂类似，仪器分析一般采用GC-MS或GC-MS/MS. TBCO异构体在进样口发生热转化是需要特别注意的问题，缺乏特异性的分子离子限制了LC-MS/MS在TBCO定量分析中的应用. 目前尚缺乏TBCO对映体单体的标准品和同位素标品，因此对映体的定量检测存在一定的不确定性. 关于TBCO异构体和对映体的测定还没有建立国际公认的标准分析方法.

b) TBCO已在生物和非生物介质中被检测到. 但TBCO的生物富集、转化是否存在异构体选择性，以及对映体降解的选择性是否来源于对映体富集的选择性尚不明确. 目前研究仅限于TBCO总量的降低和对映体分数的变化，未涉及代谢转化产物的鉴定，因此无法阐明代谢途径. TBCO是否如HBCD一样存在脱溴、羟基化等Ⅰ相代谢物以及与生物分子结合的Ⅱ相代谢还是未知数. 由于质谱数据库和代谢物标准品的缺乏，对TBCO降解转化产物的鉴定也成为研究的重点和难点. 对代谢途径认识的不足严重制约了对TBCO在环境中转化和最终归趋的探究. 可以考虑对TBCO对映体单体及其典型的代谢产物进行精确的制备，以期全面阐述TBCO异构体和对映体的选择性环境行为.

c) 与大量HBCD个体水平、细胞水平的毒性效应以及各种组学手段的研究相比，关于TBCO毒性的研究刚刚起步. 体外试验和青鳉活体试验表明，TBCO具有内分泌干扰毒性和生殖发育毒性. 最近的研究发现，TBCO能够引起神经细胞凋亡. 转录组学和蛋白质组学的研究结果表明TBCO损害青鳉的生殖发育能力，尚缺乏从代谢组学角度进行的毒性研究; 同时，异构体、对映体水平上的毒性效应研究尚未开展. TBCO毒性效应是否具有异构体、对映体选择性还是未知数,深入全面地揭示TBCO的毒性效应及其分子机制是未来工作的重点.