多房棘球绦虫粪抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立

吴小霞，赵 莉，王冰洁，班万里，穆尼拉·特列吾汗，马长丽，乌云花，布于其其格，陈云英，段兰利，岳 城，徐 晶，艾沙江，张壮志*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830000; 2.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐 830011; 3.新疆塔城地区动物疫病预防控制中心，新疆塔城 834300; 4.新疆博尔塔拉蒙古自治州博乐市畜牧兽医站，新疆博乐 833400; 5.新疆博尔塔拉蒙古自治州温泉县畜牧兽医站，新疆博州 833000)

泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，Em)的幼虫阶段引起的严重威胁生命的人兽共患疾病[1-3]，造成了严重的社会经济问题。人体感染主要原发于肝脏(病变呈肿瘤样生长)，潜伏期长，致死率高，又被称为“虫癌”[4]。在我国主要流行于北部、西北部和西南部的农牧区以及高寒地区或冻土地带[5-7]，其中又以四川、青海、西藏、甘肃等省(区)最为严重[8]。因此，免疫预防手段切断病原循环成为控制该病研究的方向[9]。

本试验探索了Em虫体抗原双抗体夹心ELISA免疫检测技术的拓展应用，其能够快速、安全、明确地检测感染区食肉动物Em感染情况，为泡型包虫病的预警预报等流行病学调查提供数据。本试验的技术和取得的相关数据可为以后获得Em虫体感染粪抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒提供候选抗体，也为今后开展相关免疫检测学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 Em感染试验比格犬来源 试验用犬购自常州贝乐实验动物养殖有限公司，7月龄～8月龄，体重8 kg～9.5 kg；使用丙硫咪唑和吡喹酮驱虫1周后，每只犬经口人工感染Em原头蚴，共感染5只犬，设阴性对照犬1只。Em原头蚴由新疆畜牧科学院兽医研究所国家动物包虫病参考实验室提供。

1.1.2 实验兔 健康成年的雄性新西兰大白兔，体重2 kg，购自新疆实验动物中心。

1.1.3 杂交瘤细胞株5E10H5 多房棘球绦虫成虫可溶性抗原免疫Balb/c鼠制备的杂交瘤细胞株，由新疆畜牧科学院兽医研究所国家动物包虫病参考实验室保存。

1.1.4 主要试剂与仪器 BCA蛋白含量分析试剂盒，美国Thermo公司产品；弗式完全佐剂(CFA)、弗式不完全佐剂(IFA)，美国Sigma公司产品；R2驴抗兔二抗(HRP)IgG抗体，美国HyClone公司产品；大型离心机，德国Eppendorf公司产品；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；Infinite F50型全波长酶标仪，众志翔有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 Em虫体可溶性抗原制备及蛋白浓度测定 将上述1.1.1中收集的Em虫体用无菌的PBS缓冲液冲洗数遍，加入等体积的Triton X-100超声破碎，3 500 r/min离心10 min，收集上清液(Em虫体可溶性抗原)，经BCA蛋白含量分析试剂盒进行抗原含量测定，分装后置-20℃保存备用。

1.2.2 高效价抗体制备、测定、动态监测及高效价血清收集 首免取CFA将1.2.1中获得的Em虫体可溶性抗原制成免疫物，即200 μg Em虫体可溶性抗原混悬液加等体积CFA混合，充分乳化后0.2 mL/只颈背部皮下多点注射接种新西兰大白兔；每间隔14 d后进行二免和三免，取IFA 200 μg将Em虫体可溶性抗原制成免疫物，同首免接种免疫。首免开始，每周定期收集血清。按照间接ELISA方法检测多克隆抗体效价；多抗血清按1∶200稀释进行动态监测。结果判定：当P/N≥2，即按梯度稀释后多克隆抗体血清效价与0周阴性对照血清OD450 nm值的比值在2倍以上。依据高免血清效价和动态监测结果，对高免兔仍需进行加免(IFA)，收集高效价血清，置-20℃保存，备用。

1.2.3 Em犬粪样品的收集与处理 根据1.1.1所述自Em原头蚴感染起每天定期采集粪样。感染25 d后安乐处死，根据常规方法剖检后收集肠内容物，1×PBS洗涤并获得虫体和粪抗原于-70℃冷冻保存。共获得Em感染犬粪154份，阴性对照犬粪25份。每份粪样必须清楚标记犬号、采集日期置-70℃冻存1周。随后称取1 g～2 g粪便与4 mL离心管中，加入1×PBST 2 mL～4 mL充分混匀，置4℃冰箱沉淀过夜。第2天以3 500 r/min离心10 min，吸取上清至新的离心管中，上清即粪抗原。

1.2.4 双抗体夹心ELISA方法的建立 依据双抗体夹心ELISA原理，利用棋盘法开展包被抗体，对多克隆抗体、单克隆抗体以及二抗工作浓度进行测定，确定其工作浓度，参照犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术国家标准[10]，建立以多房棘球绦虫虫体抗原单克隆抗体为包被抗体、高效价血清作为检测抗体的粪抗原双抗夹心ELISA方法。将单克隆抗体(5E10H5腹水)通过包被液按照优化稀释度稀释，0.1 mL/孔包板，4℃冰箱过夜。PBST洗3次，3 min/次；加入50 g/L脱脂奶粉0.2 mL/孔，置于37℃温箱60 min，PBST洗3次，3 min/次；检测不同浓度的多房棘球绦虫虫体蛋白(EmsfAg)与Em犬粪样，并设置阴性对照和空白对照，0.1 mL/孔，37℃温箱孵育1 h，PBST洗3次，3 min/次；用工作浓度为1∶5 000的多克隆抗体与工作浓度为1∶5 000的驴抗兔反应。多克隆抗体0.1 mL/孔，置于37℃温箱孵育1 h，PBST洗3次，3 min/次；二抗驴抗兔，37℃温箱孵育1 h，PBST洗7次，3 min/次；加入TMB 0.1 mL/孔，遮光显色10～15 min，加入终止液，50 μL/孔，通过酶标仪测值作对比分析。建立方法见表1。结果判定：以阳性/阴性(P/N≥2)即抗体梯度与阴性对照OD450 nm值相比在2倍以上。

表1 双抗体夹心ELISA方法建立

1.2.5 双抗体夹心ELISA灵敏度检测 用1.2.4建立的粪抗原双抗夹心ELISA方法检验粪样，测试出蛋白和粪样的最低检测值。灵敏度检测加样示意见表2。

表2 灵敏度检测加样示意

1.2.6 Em感染犬粪抗原动态检测 对1.2.3中采集的154份感染Em犬粪样和25份阴性犬粪样，用1.2.4建立的双抗体夹心ELISA方法对感染犬的粪抗原动态进行检测。

2 结果

2.1 Em成虫可溶性抗原的含量

结果见图1。经BCA法测定得出Em成虫提取物可溶性抗原含量为8.7 mg/mL。

图1 BCA抗原含量标准曲线图

2.2 多克隆抗体效价测定及动态监测结果

三免后按照间接ELISA方法检测实验兔血清中的抗体效价。如表3结果显示，抗体效价为1∶320 000。图2动态监测结果表明，第3次免疫后多克隆抗体血清效价逐渐上升，且补免后动态监测图显示依然呈平稳趋势。可持续采集高效价血清(1∶320 000)用于双抗体夹心ELISA方法以及灵敏度检测。

表3 兔多克隆抗体效价测定

图2 兔多克隆抗体血清效价动态趋势

2.3 双抗体夹心ELISA方法建立

表4结果表明，最终建立以浓度为2 μg/mL 5E10H5腹水包板，Em虫体多抗血清工作浓度为1∶5 000与二抗驴抗兔工作浓度为1∶5 000的反应作为粪抗原检验方法。

表4 双抗体夹心ELISA方法检测结果

2.4 灵敏度检测结果分析及效果评价

通过对3个标准阳性样品倍比稀释，全部OD450 nm值均 ≥ 0.9，如表5表和6结果表明，阳性粪抗原最终稀释至1∶10 000倍时仍显示为阳性。

表5 灵敏度检测结果

2.5 感染犬动态检测结果分析

检测结果见图3。感染犬最早72 h后，最迟6 d后可检测出多房棘球绦虫粪抗原。C犬和2#犬的监测趋势走向相一致，而A犬前5 d粪抗原相对较低，整体而言，人工感染5只犬其7 d后虽有幅度，但通过与阴性对照犬D犬相比，均呈阳性。检出的阳性犬粪样OD值/阴性犬粪样OD值均≥2.0(P/N)。

表6 灵敏度检测效果评价

D犬为阴性对照犬；2#、3#、A犬、B犬、C犬均为人工感染Em犬

3 讨论

当前，AE早期诊断仍然面临着艰巨的挑战。针对人体的感染，以手术治疗为主，但是经常伴有术后复发和继发感染[11]。针对动物以往使用剖检法[12]检测犬棘球绦虫，发现该虫卵形态与其他绦虫虫卵形态相似，很难区分，结果容易出现误差；现普遍采用剖检法，对家畜出栏屠宰后进行棘球蚴感染的流行病学调查，对可疑病灶或包囊、一种宿主可感染多种棘球蚴等有时无法鉴定[13]；氢溴酸槟榔碱下泻法反应率低、错检或漏检率高且容易造成环境污染等问题。截止2016年8月，全球报道的AE患者占棘球蚴病的5.78%，而我国2012年-2016年报道的占棘球蚴病的19.64%[14-15]。与此同时，制定有效的能够快速、准确、高效检测多房棘球绦虫粪抗原检测方法就变得非常重要。张壮志等[10,12]报道利用重组抗原制备了兔多抗，建立的双抗夹心ELISA方法特异性为95.7%。本次试验制备的兔多克隆抗体经过3免后定期加强，效价达1∶320 000以上，隔周采集血清，通过动态监测OD值均达2以上。

本研究建立的定量检测方法具有良好的特异性、准确性、和灵敏度。近年来，夹心ELISA法已广泛应用于肠道寄生虫病的诊断，且不会对犬造成任何损伤。根据有关资料显示，粪抗原检测法敏感性高，是镜检的2.6倍，在检测时，使用该方法更为安全、快捷，弥补了监测空白性，即能够解决实践问题，在流行病学调查方面值得应用推广。在双抗体夹心ELISA法的建立中2 μg/mL或5 μg/mL单抗包板表现的效果相近，为了节省材料选择2 μg/mL，经过多克隆抗体效价测定、动态监测及对灵敏度的检测，确定多克隆抗体与二抗工作浓度一致。在灵敏度方面，阳性粪样(P3)在依次稀释中前三比值低于1∶1 000，出现跳值可能操作不当，但总体来说3个阳性样品稀释至1∶10 000倍时OD值均在0.9以上，仍然为阳性。结果显示，犬感染Em最早72 h后，最迟6 d后的犬粪样中可检测到多房棘球绦虫粪抗原，本试验Em感染5只犬中其中B犬和3#犬是最早检测出的，由于感染犬的数量不均一性和粪样样品少的原因，得到的动态检测图曲折变化较大，说明获得的粪样样品可能为假阴性。因此建立Em粪抗原双抗夹心ELISA检测方法后期还需要开展大量工作。

国外曾报道采用血清诊断法检测犬只棘球绦虫的感染，此方法不仅敏感性变异较大，而且和其他带科绦虫有交叉反应，区别不了现症和既往史感染，其应用受到限制[16]。本研究建立的方法，粪抗原双抗夹心ELISA法提高了反应灵敏度，粪抗原可稀释至1∶10 000，只针对于抗原稀释倍数来说此方法敏感性较高。表明该方法在犬多房棘球绦虫感染中具有早期诊断的功能。本试验通过Em虫体可溶性抗原免疫Balb/c小鼠制备的杂交瘤细胞株腹腔接种小鼠获得单抗腹水(5E10H5)以及该抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，用驴抗兔二抗，检测收集的Em感染犬粪和阴性对照犬犬粪，用双抗夹心ELISA检测方法评估Em虫体可溶性抗原能够作为多房棘球蚴病的诊断抗原候选[17]，本试验建立的方法，粪抗原可稀释至1∶10000，表明本方法具有良好的灵敏度与特异性。这种双抗体夹心检测方法为后期各个地区做流调提供技术支持以及为后期研制Em粪抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒奠定了基础。