鸡MHCⅠ分子三维结构与抗原多肽结合特征的研究进展

金元昌，曹清国，郑传丹，曾 钢，郝美林，姜丽霞，陈明丽

(1.遵义师范学院，贵州遵义 563006；2. 内蒙古牙克石市乌尔其汉镇综合保障和技术推广中心，内蒙古牙克石 022159)

脊椎动物依靠免疫系统来抵抗、防御病原微生物的侵袭，其免疫应答被分为天然免疫和获得性免疫，获得性免疫包括体液免疫和细胞免疫，细胞免疫主要由细胞毒T细胞(CTL，CD8+)完成。CTL对靶细胞有特异杀伤作用，它自身并不能直接识别抗原，而是需要抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)协助。APC能够有效摄取病原微生物或其他抗原并将其加工成8个～11个氨基酸的短肽，再由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子(MHCⅠ)递呈到细胞表面。抗原肽被递呈表达后，T细胞上的抗原受体(T cell receptor，TCR)识别并结合MHCⅠ-抗原肽复合物，在CD8分子协助下T细胞和APC相互作用，启动CTL(效应T细胞)活化信号转导途径。

效应T细胞通过激活靶细胞内的溶酶体酶使靶细胞裂解死亡，其中TCR-MHCⅠ-抗原肽复合物为激活特异性CTL的关键结构。只有MHCⅠ递呈了合适的抗原肽并与TCR相互作用才能激发CTL免疫应答。因此，MHCⅠ分子是CTL免疫应答的核心分子，也是结构免疫学的研究热点。

MHCⅠ存在于大多数真核细胞中，由α链和β2m两部分以非共价键结合组成，前者由MHC基因所编码，具有多态性；后者由非MHC基因所编码，不具备多态性。以人MHCⅠ(HLA-A2)为例，α链胞外部分由α1、α2和α3三个结构域组成，每个结构域包含大约90个氨基酸；α链跨膜区结构域由大约25个疏水氨基酸构成，其后有一小段带电亲水氨基酸；α链胞质尾区由30个氨基酸组成(图1)。α1和α2结构域位于MHCⅠ的顶部，具有相似的三级结构，其螺旋结构域远离细胞膜，指向外部，供TCR识别。α1和α2都含有一个反向平行的β片层和一个长的α螺旋区域，两者共同形成一个底部由8个β折叠组成的反向平行的β片层、两侧由两个长α螺旋构成的平台，即多肽结合槽。多肽结合槽位于MHCⅠ分子的顶部，抗原多肽平躺在此凹槽中。根据抗原多肽结合情况，整个MHCⅠ多肽结合槽可以划分成6个口袋，依次为A～F。每个口袋都由一组MHCⅠ氨基酸构成，表现出不同的形状、大小、化学性质和带电性等[1]。抗原多肽上的侧链能够结合到以上口袋中并且形成比较强相互作用的氨基酸称为锚定残基，含有这些锚定残基的多肽序列则称为多肽基序。

图1 MHCⅠ类分子及其编码基因的结构

1987年，HLA-A2的三维晶体结构首次被解析，目前，蛋白质结构数据库(protein databank,PDB)中储存已测定的鸡MHCⅠ分子结构共有14个，其中涉及B2、B4、B14和B21单倍型，全部由X线衍射技术测定并解析。MHCⅠ分子本身是一个跨膜蛋白，但由于之前的技术条件所限，无法制备出X线衍射技术所需的跨膜蛋白晶体，所以目前PDB中所有生物的MHCⅠ分子都未能包含跨膜区和胞质尾区。

本文从结构免疫学角度，重点解析鸡MHCⅠ类分子三维结构与抗原多肽结合特征对MD/RS遗传抗性的影响，为养禽业中抗病育种、病毒多肽抗原筛选以及疫苗设计提供参考。

1 MHCⅠ分子与脊椎动物多种疾病的抗性相关性研究

1.1 MHCⅠ分子与哺乳动物以及禽类多种疾病的抗性相关

MHC由一组紧密连锁、高度多态的基因座位组成，在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面起极其重要的作用。不同物种的MHC分子结构有所差异，但在组织分布和功能等方面却有许多类似的特征。研究发现，哺乳动物和禽类MHC分子的外部整体结构大致相同，大部分高度变异的氨基酸残基都发生在其α链的抗原结合区，且部分高度多态的残基位于不同物种的相同位置。这些高度多态的氨基酸位点，可能更有利于MHC分子空间结构的微调整，使其参与不同抗原肽的识别与递呈[2-4]。由MHC的表达产物广泛参与各种病原体抗原的识别，其遗传背景的差异可导致不同个体抗病能力的差异。目前已经证实，MHC与哺乳动物以及禽类多种疾病的抗性相关[5-7]，然而哺乳动物MHC的多样和复杂性导致其相关研究较为困难。与哺乳动物相比，鸡MHC结构简单且紧密，具有最低限度的功能基本单元。因而，禽类系统被认为是研究MHC与疾病关系的潜力候选载体。

鸡MHC(又称B复合体)包含B和Y两个主要区域。B区包括3个基因群,即BF、BL和BG，其中BF和BL所编码的抗原在结构和功能上分别与哺乳动物MHCⅠ类和MHCⅡ类分子类似。B复合体也与鸡多种疾病的抗性相关[8-9]，比如马立克氏病(Marek's disease，MD)、劳氏肉瘤病(Rous sarcoma，RS)、禽白血病(Avian leukosis，AL) 和禽流感病(Avian influenza，AI)等病毒性传染病。

马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)属于疱疹病毒，基因组为双链DNA，至少编码80种蛋白。MDV感染可引起鸡的淋巴组织增生性肿瘤病，具有高度传染性并造成鸡只死亡，MD被列为世界养禽业最重要的疾病之一。Briles W E等[10]对B复合体在白来航鸡N系和P系中的影响进行研究，结果证明B21单倍型对MD的抗性远高于B19。Briles W E等[10]对一系列 B单倍型鸡影响MD抗性的研究结果进行总结，指出B21具有最强的MD抗性， B2具有中等抵抗力，而B15、B13和B19最为易感，这充分说明B复合体与MD抗性存在相关性。Briles W E等[11]报道了MD抗性品系和易感品系中B复合体的差异情况，结果表明MD抗性与B复合体BF区相关，而且很可能与MD抗性相关的主效基因就存在其中。

劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)是一种基因组较小的反转录病毒，只编码4个基因。鸡对RS的抗性也与B复合体有关，B2和B12单倍型表现出较强的抗性，而B4、B5和B15则易感[12]。Khare V M等[13]报道，B2、B21和 B22单倍型表现出较强的抗性，而B13、B13.1、 B15、B15.1和 B15.2则易感。研究表明RS的抗性基因也主要位于BF区。

1.2 MHCⅠ分子结合抗原谱与禽类多种病毒性传染病的抗性相关

Kaufman J等[14-16]对白来航鸡B12单倍型B区的全部基因进行序列测定。发现B区全长92 kb，包含19个基因，长度不足人MHC基因的1/20。其中，BF区的抗原加工相关载体(transporter associated with antigen processing，TAP)位于两个BF(分别为BF1和BF2)α链之间。虽然BF1和BF2分子的核酸序列类似，但二者的功能明显不同，BF2分子的主要功能是提呈抗原而BF1分子可能是NK细胞抑制性受体的重要配体[17]。与哺乳动物相比，BF2分子是鸡唯一能提呈抗原的MHCⅠ分子，也许正是这种原因致使BF分子结合抗原谱与哺乳动物比较很窄(图2)，这样就不能对某些病原微生物抗原进行有效递呈，因此就会有不同B单倍型鸡对MD和RS等疾病抗性不同的情况。

图2 鸡与哺乳动物MHC分子结合抗原谱的区别

鸡BF2分子核苷酸水平的研究已较为深入，但其基因功能的实现最终还是要靠蛋白质来完成，而且在从DNA到蛋白质的过程中还有一些已知和未知的调控机制施加影响。因此，对鸡BF2分子三维结构进行观察和研究，并着重分析其与抗原多肽相互作用关键位点的空间结构,进而从结构免疫学角度，解析鸡BF2分子影响MD/RS遗传抗性的基础[18]。

2 鸡BF2分子三维结构与抗原多肽结合特征的研究

2.1 天然BF2分子肽结合基序的研究

通过体外肽洗脱和测序的方法， Kaufman J等[19]和Wallny H J等[12]]成功的获取了B15、B12和 B4单倍型鸡天然BF2分子肽结合基序，它们的多肽基序表现一定的规律性，且只能结合少数几种抗原肽。而Chappell P等[20-21]和Koch M等[22]在研究B21、B14和B2天然BF2分子肽结合基序时发现，洗脱下来的多肽没有表现一定的规律性，非常杂乱。

2.2 非跨膜BF2分子肽结合基序的研究

Koch M等[22]对体外构建B21非跨膜的BF2分子BF*2101的结构进行研究，得到2个结合不同多肽的晶体结构。结构显示，BF*2101的多肽结合槽异常大(平均为1 570 Å3)、入口宽(14.42 Å)，使得Arg9处在一个相对中间、突出的位置，活动范围较大，完全可以随着周围环境的变化而改变构象，借助盐键形成，以多种可能的形态发挥其在抗原多肽结合过程中的锚定作用。这使得BF*2101有更大的可能性结合并呈递多种抗原多肽，引发相应的免疫反应，表现为MD/RS抗性。ZHANG J等[23]对体外构建B4非跨膜的BF2分子BF*0401的结构进行研究，得到了3个结合不同多肽的晶体结构(BF*0401-IE8、BF*0401-P5A和BF*0401-P8D)。结构显示，该分子的多肽结合槽体积较小(平均为1 130 Å3)、入口狭窄(10.23 Å)、Arg80的指向具有倾向性以及Arg9、Arg80和Arg111这3个“口袋”位置的关键氨基酸均为正电荷，这3个因素导致了B4单倍型BF2分子只能与少数的锚定残基结合，因而其在结合抗原多肽上有着严格的限制性，引发免疫反应的抗原谱很窄，表现为MD/RS易感。王威等[24]利用PyMol等软件对B2非跨膜的BF2分子BF*0201的结构进行研究，得出了B2单倍型比B4单倍型BF2分子能结合更多种类的锚定残基，与之相反，B2单倍型比B21单倍型BF2分子能结合更少种类的锚定残基，因而B2单倍型BF2分子在结合抗原多肽的限制性上介于B4和B21单倍型之间，引发免疫反应的抗原谱也介于二者之间，因此表现为MD中等抗性以及RS强抗性。

2.3 TAP与天然BF2分子肽结合基序的比较

抗原递呈中多肽选择有3个关键环节，一是低分子量蛋白酶体对细胞浆中多肽前体蛋白的选择性水解作用，二是TAP对多肽转运的特异性，三是MHCⅠ分子对多肽结构的要求。这些选择作用均决定于对多肽疏水性羧基端结构和重要位点氨基酸残基的识别。鸡MHC基因极低水平的重组，使得MHCⅠ、TAP和TAP相关蛋白这些功能上相互(或单向)影响的基因能够共同进化[14,20]。与人等胎盘类哺乳动物相比较，鸡的TAP高度多态[14,25-26]。在将抗原肽输送到粗面内质网腔内时，鸡TAP偏好性使其结合抗原肽具有特异性，Walker J等[14]研究表明,鸡B4和B15单倍型TAP肽结合基序分别如下，B4：x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E；B15：(K或R)-R-x-x-x-x-x-(Y或F或W)。而Wallny H J等[12]]通过体外肽洗脱和测序方法得到天然的B4和B15单倍型BF2分子肽结合基序分别如下，B4：x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E；B15：(K或R)-R-x-x-x-x-x-Y或者(K或R)-R-x-x-x-x-x-x-Y。比较发现，鸡TAP的这种偏好特异性与BF2分子肽结合基序特点基本相符，这也许是TAP和BF基因共同进化的结果。其中，对于B4，二者肽结合基序完全相同；而对于B15，TAP肽结合基序范围略大于BF2分子。Tregaskes C T等[27]分别对B21和B15 TAP和BF2分子肽结合基序研究也表明，TAP肽结合基序范围大于BF2分子。综合以上，TAP肽结合基序范围大于等于BF2分子，这也符合抗原递呈3个关键环节过程中，抗原多肽选择范围应该逐步缩小的推测。

2.4 非跨膜BF2分子与天然BF2分子肽结合基序的比较

ZHANG J等[23]体外构建B4非跨膜BF2分子BF2*0401-P5A和BF2*0401-P8D两个晶体结构和2.3这个推论(TAP肽结合基序范围大于等于BF2分子)不符，其BF2*0401分子肽结合基序P5A(IDWFAGKE)和P8D(IDWFDGKD)竟然超过了TAP肽结合基序范围，况且体外肽洗脱和测序的方法也表明天然BF2分子肽结合基序也不包括P5A和P8D。所以，虽然非跨膜BF2分子和天然BF2分子结构基本相符[12,23]，但是两者间还是有差别的。据此分析，BF2分子的跨膜区和/或胞质尾区可能对其结构完整性有一定影响，跨膜BF2分子结构应该更接近天然BF2分子。

3 脂立方相技术体系对膜蛋白结构与功能研究的现状

虽然膜蛋白具有重要的生理意义，其结构生物学的进展却远落后于可溶蛋白。一个主要原因是，膜蛋白在从其天然脂双层环境中分离到由去垢剂组成的囊束结构后稳定性变差，给结晶工作造成困难。而脂立方相比囊束结构更接近天然磷脂双分子层，因而可更好地维持膜蛋白的稳定性[28]。脂立方相所解析的膜蛋白结构分辨率一般都较高，在3.0 Å和2.5 Å以上的比率分别为83%和58%，它已经成功地解析了多种膜蛋白结构。一般的结晶过程都是在体外进行，与生理环境条件迥异，因此，晶体结构是否代表功能构象?同样，作为结晶介质，脂立方相是否支持膜蛋白活性、膜蛋白在从去垢剂向脂立方相重构的过程中是否有活性丧失等?磷酯酰甘油磷酸合成酶和二酰基甘油激酶在脂立方相中的活性测定实验等研究证明脂立方相支持膜蛋白天然活性。

解析蛋白分子结构的最主要手段是X射线晶体学技术，但大小合适的蛋白分子晶体的获取是X射线晶体学技术的难点。尽管小晶体相对于大晶体较容易获取，前者容易受到辐射损伤，很难获得完整的结构信息。利用激光光刻技术制作用于多颗晶体上样的芯片，实现高通量的多颗晶体衍射数据收集，将多套数据进行合并，获得无明显辐射损伤的生物大分子结构信息。基于芯片的晶体上样技术为晶体学研究者提供了一种利用微聚焦光束线站进行小晶体衍射数据收集并获得无明显辐射损伤高质量衍射数据的高效手段[29-30]。

4 结语

鸡非跨膜BF2分子结构的研究已经有了一定程度进展，它和天然BF2分子基本相符，而跨膜BF2分子结构似乎更接近天然BF2分子，不过由于之前无法制备出X线衍射所需的跨膜蛋白晶体，截止目前PDB中所有生物的MHCⅠ分子都未能包含跨膜区和胞质尾区。因此，利用分子克隆、蛋白纯化以及脂立方相等技术获取B4单倍型鸡跨膜BF2分子三维结构，然后对其进行如下研究：首先，通过对比已报道的B4非跨膜BF2分子，明确其是否更接近天然BF2分子；其次，阐述其结合抗原多肽的特征；第三，分析B4单倍型鸡对MD/RS易感性的结构学基础。为养禽业中抗病育种、病毒多肽抗原筛选及疫苗设计提供理论依据，也为鸟类MHC进化研究提供线索。