纳米抗体与疫病防治

李静颖，李志伟，肖书奇

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

人类与动物疫病多为流行性急性传染病，主要包括细菌性疫病、病毒性疫病、寄生虫疫病等类型。疫病可造成大范围的流行和传播，对人类健康和社会经济造成巨大威胁。目前，抗体已被广泛应用于疫病的诊断与治疗中[1]。其中，单克隆抗体药物在治疗性药物中占据主导地位[2]。但单克隆抗体较大、稳定性低、制备过程复杂，影响其应用效果，难以应对突发性疫病。

1993年，Hamers-Casterman C等[3]在骆驼科动物血清中发现了一种天然缺乏轻链的抗体，称之为重链抗体(heavy chain antibodies，HCAbs)。克隆其可变区可以得到仅由重链可变区构成的单域抗体(single domain antibody)，称为VHH(variable domin of heavychain antibody)抗体。VHH具有与原HCAb相当的结构稳定性及抗原结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体直径2.2 nm，长4.8 nm，分子质量仅15 ku，因此又名纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体具有特殊的天然结构，与传统抗体相比，在功能上具有更多优势，拓宽了抗体的应用范围。本文主要针对纳米抗体的特殊结构和特性及其在疫病检测和治疗领域的应用进行综述。

1 纳米抗体的结构特性

哺乳动物的抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，与之相比，骆驼科动物的HCAbs不含轻链多肽和重链多肽的第1个恒定域。HCAbs的重链可变区构成的抗体，即纳米抗体，其分子质量为15 ku[4]，约为一般抗体的1/10。

与常规IgG中的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)基因相似，骆驼HCAbs中编码VHH的基因也是由4个相对保守的框架区(framework regions,FRs)和3个高变区(hypervariable region,HVR)构成。但骆驼VHH与人体VH之间也存在区别。首先，它们的互补决定区 (complementarity determining region,CDR) 不同。VHH的CDR1和CDR3更长，且CDR3形成凸型结构[5]，一定程度上补偿了轻链缺乏造成的结合力下降的问题。在CDR1和CDR3中含有半胱氨酸残基，可以形成二硫键，有助于连接成环状。其次，两者FR2中氨基酸种类不同。普通抗体的Val 37、Gly 44、Leu45和Trp 47共4个氨基酸残基在纳米抗体中被突变为亲水性的氨基酸残基Phe 37、Glu 44、Arg 45和Gly 47[4]，从而增加了纳米抗体的水溶性。

VHH的二级结构包含9条β链，折叠成两个β片层；3个高变区聚集在一侧形成环状结构，参与抗原的识别[4]。

2 纳米抗体的生物学特性

2.1 高溶解性和稳定性

VH结构域单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附。由于纳米抗体FR2中的疏水氨基酸残基突变为亲水残基，因此其溶解性增加，聚合性减少，提高了药物的利用率。

研究表明，小鼠单克隆抗体在70℃或以上温度下暴露2 h后会丧失与抗原结合的能力，而部分纳米抗体在90℃条件下依然能够结合抗原[6]。VHH内部存在二硫键是其耐高温的主要原因。此外，纳米抗体的保存期长，在4℃下可保存数月，37℃下可长时间保持与抗原结合的能力，比常规抗体更易于储存。在某些条件，例如乙醇溶液中、含蛋白酶的极端pH环境下(胃和肠道中)和某些变性剂溶液[7]中，纳米抗体仍然能够保持较高的耐受性。

2.2 抗原结合能力强

纳米抗体具有较长的CDR3，可形成稳定的凸形结构，更容易进入抗原结构的内部结合隐蔽的位点，从而使其能够结合凹形或空间受阻的抗原[5]。而普通抗体只能识别抗原表面的位点。因此，纳米抗体具有广泛的抗原识别范围，包括小分子、蛋白质和病毒等。

2.3 低免疫原性

纳米抗体并非人源抗体，但其体积小，且与人VH3基因家族具有较大的序列同源性，因此纳米抗体的免疫原性较低，生物相容性较好[7]。为了进一步降低纳米抗体的免疫原性，可将特定纳米抗体的CDR移植到人源化的支架上[8]，获得低免疫原性的纳米抗体。

2.4 高表达性

由于纳米抗体分子量小、由单一基因编码且具有亲水性，编码纳米抗体的DNA易克隆并在微生物中大量可溶性表达。利用原核和真核表达系统可以进行大规模生产，从而缩短生产周期，降低生产成本。

3 纳米抗体在疫病防治中的应用

纳米抗体自从被发现以来就受到了研究者的广泛关注。2019年2月，美国FDA批准了法国制药公司赛诺菲研发的用于获得性血栓性血小板减少性紫癜药物Cablivi，这是FDA首次批准的纳米抗体药物[9]，但与病原微生物、寄生虫感染相关的纳米抗体药物尚在研发过程中。由于纳米抗体结构和功能的特殊性，针对它的研究愈加深入，在人、畜疫病防控方面已有许多研究成果。

3.1 针对病毒的纳米抗体

3.1.1 人类疾病 纳米抗体可通过吸入方式靶向治疗人类呼吸系统感染性疾病[10]。现阶段，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)所引起的2019冠状病毒病(coronavirus disease-19，COVID-19)席卷全球，已造成全球超过2 620万的确诊人数和超过86万人的死亡。 目前，寻找有效的抗病毒药物或疫苗已成为亟待解决的难题。单克隆抗体制造过程花费时间长、成本高，在当前流行病情况下无法及时生产。相比较而言，纳米抗体体积小，可在微生物表达系统中大量生产，为药物生产提供一种思路。

SARS-CoV-2表面具有三聚体刺突(S)蛋白，S蛋白受体结合域(receptor binding domain ，RBD)与2型肺细胞和肠上皮细胞的细胞膜上的血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme-2，ACE2)结合，并在细胞跨膜丝氨酸蛋白酶2帮助下促进病毒进入宿主细胞[11]。因此，S蛋白被作为纳米抗体研制的靶点。Wrapp D等[12]筛选出针对S蛋白的纳米抗体。该纳米抗体可与SARS-CoV-2的RBD结合并显著抑制病毒复制。其他研究团队将目光放在了人源化纳米抗体上。Wu Y等[13]将全人源的重链可变区骨架进行筛选重构，设计了全人源的噬菌体展示纳米抗体库。以SARS-CoV-2的RBD结构域和S1蛋白作为抗原，在库中筛选出纳米抗体并在大肠埃希氏菌系统中表达。筛选得到的纳米抗体具有较强的中和活性，部分靶向了S蛋白特殊的隐藏表位。Dong J等[14]利用SARS-CoV-2 S1蛋白筛选美洲驼人源VHH库，得到了VHH基因与人IgG Fc结构域融合纳米抗体，以降低免疫原性。产生的VHH-Fc抗体与S蛋白有很好的结合能力并阻断S蛋白与其受体ACE2结合。尽管这些纳米抗体的应用性还需要进一步的研究，但其有望成为COVID-19有效的防治药物。

中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome， MERS)是MERS-CoV引发的人畜共患的冠状病毒病。迄今为止尚未出现批准的疫苗或治疗性药物。MERS-CoV S1亚基中的RBD介导病毒进入宿主细胞。目前出现的纳米抗体包括由大肠埃希氏菌表达系统产生的4株VHH[15]和由酵母表达系统产生的NbMS10[16]。NbMS10对不同株系的MERS-CoV具有很强的交叉中和保护作用，拥有广谱抗MERS-CoV治疗潜力。在NbMS10基础上还开发了二聚和三聚纳米抗体，显著提高了与RBD的结合性和交叉中和活性，体现了强大的热稳定性及抗极端条件的能力[17]。

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)被认为是导致婴幼儿急性下呼吸道感染的最重要病毒病原体。ALX-0171是针对RSV的三聚体纳米抗体[18]。得益于纳米抗体的高溶解度、强稳定性和低黏度，ALX-0171被设计为雾化器溶液，可通过滴鼻给药来递送药物，使其到达感染部位发挥作用[10]。现已通过Ⅱ期临床试验，具有潜在的抗RSV治疗价值。

除了治疗呼吸系统感染性疾病之外，纳米抗体还可应用于疾病的检测。诺如病毒是造成人类肠胃炎的重要病原体之一，也是造成地方流行性腹泻的常见病因。靶向诺如病毒的纳米抗体Nano-85可以利用ELISA法从临床样本中检测出不同基因型的诺如病毒样颗粒[19]，此种快速检测方法有助于减少诺如病毒的传播。此外，Nano-26和Nano-85可破坏诺如病毒衣壳的完整性，抑制病毒粒子进入细胞[20]，有望开发成新的抗诺如病毒的的治疗制剂。

3.1.2 家畜和家禽疫病 纳米抗体在家畜和家禽的疫病防控研究中应用也十分广泛。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是影响全世界养猪业的重要病毒性疾病之一，每年给养猪业带来巨大的经济损失。PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是引起该病的原因，当前疫苗无法起到有效控制PRRSV感染的作用。非结构蛋白9(non-structural protein 9，Nsp9)是PRRSV的一种序列保守的非结构蛋白，具有RNA依赖性RNA聚合酶活性，在病毒复制、转录中起到关键作用。因此，Nsp9可以作为抗病毒的靶标。Liu H等[21]针对Nsp9筛选出特异性的纳米抗体Nb6，并建立稳定表达Nb6的细胞系Marc-145。经过试验证明，Nb6可特异性识别Nsp9，并通过抑制病毒基因组复制和转录来阻断PRRSV的复制。在此基础上，Wang L等[22]将该纳米抗体Nb6偶联细胞穿膜肽并进行原核表达。细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)是一种可以有效进入细胞的小分子多肽，可携带一些大分子穿过细胞膜进入胞质或者胞浆甚至是细胞核内，并对宿主细胞没有明显的毒副作用。人类免疫缺陷病毒1型反式激活蛋白TAT蛋白也是其中一类。TAT和纳米抗体Nb6在大肠埃希氏菌中表达为融合蛋白TAT-Nb6，可以有效进入Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞，具有抑制PRRSV复制的功能。纳米抗体有望成为治疗PRRS的新型抗病毒策略。

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由BVD病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的病毒病，给全球畜牧业带来巨大经济损失。利用序列保守的非结构蛋白NS5B免疫双峰驼，并构建VHH文库。随后通过噬菌体展示技术筛选得到3株特异性强且亲和力高的纳米抗体。经过细胞试验表明，其中的Nb1可以强烈抑制BVDV的复制[23]，具有成为新型抗BVDV制剂的潜力。

纳米抗体在动物疫病检测中也起到重要作用。家禽的新城疫是一种高发病率和病死率的疫病，严重危害养禽业发展。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是造成新城疫发生的病原体。目前，血凝抑制试验仍然是检测家禽血清中抗NDV抗体水平的最广泛的血清学方法。然而，该检测方法常产生高假阳性率，并且操作繁琐。Sheng Y等[24]研制了辣根过氧化物酶与纳米抗体的融合蛋白，并开发了竞争性ELISA方法，称作cELISA，用于检测抗NDV抗体水平。经过测试，该方法与商业ELISA试剂比较具有更高的灵敏度。cELISA在新城疫的检测中具有良好应用前景。

3.2 针对细菌和细菌毒素的纳米抗体

使用抗生素是进行细菌感染治疗的主要途径。但是抗生素的不合理使用导致了细菌耐药性问题出现。抗体治疗在耐药性问题日趋严峻的当下显示出独特的优势。其中，纳米抗体可以高效结合细菌表面蛋白或细菌毒素，具有防治疾病的潜能。此外，以纳米抗体为基础建立的检测方法可以快速检测出细菌并及时阻断疾病的传播。

产生志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga-like toxinEscherichiacoli，STEC)是导致食源性疾病的重要原因。STEC菌株可产生志贺毒素1(Shiga toxin-1，Stx1)、志贺毒素2(Shiga toxin-2，Stx2)或其变体。其中，Stx2会扩散到靶器官肾脏，导致肾脏损伤或衰竭[25]。针对Stx2，研究者开发了用于检测或治疗的纳米抗体。Melli L J等[26]筛选出两种抗Stx2的纳米抗体，并开发了基于双VHH的生物素-链霉素捕获ELISA和分光光度检测法。该检测方法在STEC培养上清液和粪便样品中均显示出良好的敏感性，甚至优于商品ELISA的敏感性，可以用于感染STEC的临床检测。

痢疾志贺氏菌产生的毒素在结构和功能上与Stx相似。志贺氏菌很容易通过粪-口途径传播，引起志贺氏菌病，也称为细菌性痢疾。该疾病造成人类感染腹泻[27]。弗氏志贺氏菌的尖端复合体含有入侵质粒抗原D(invasive plasmid antigenD，IpaD)，Barta M L等[27]开发出针对IpaD的纳米抗体，可调节志贺氏菌的感染特性，可以减少志贺氏菌的溶血活性，具有针对志贺氏菌感染的治疗潜力。

炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)引起的急性人畜共患传染病。感染炭疽芽胞杆菌的牲畜具有较高病死率。人主要通过接触病畜或食用其肉类而被感染。临床上包括皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽，有时会引起炭疽败血症和脑膜炎。炭疽芽胞杆菌细胞表面受单晶层保护，该单晶层由S层蛋白Sap组成。靶向Sap S层的纳米抗体能减弱细菌增殖。在炭疽病小鼠的模型中，纳米抗体通过皮下注射清除了炭疽芽胞杆菌[28]，表现出纳米抗体的治疗价值和S层作为治疗靶标的潜力。

3.3 针对寄生虫的纳米抗体

寄生虫病是由于寄生虫侵入机体而引发的疾病。世界各地均有发生，在卫生条件差、经济条件落后的地区更多见。纳米抗体抗寄生虫的研究起步较晚，目前多集中于非洲锥虫病的检测和治疗。

人非洲锥虫病(Human African trypanosomiasis，HAT)也称为昏睡病，是由布氏锥虫引起的人畜共患疾病。通过苍蝇叮咬而传播给人类。该病的诊断可采用ELISA或间接免疫荧光法。Odongo S等[29]用可溶性血流形式T蛋白免疫美洲驼之后，获得了识别锥虫果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(TcoALD)的纳米抗体Nb474，基于此开发了锥虫特异性抗原检测同源夹心ELISA(Nb474-ELISA)，能够在实验室和自然条件下检测非洲锥虫的感染。深入研究发现， Nb474-TcoALD具有高亲和力，此外 Nb474可以特异性结合非洲锥虫醛缩酶，但不能结合其他锥虫醛缩酶。Pinto Torres J E等[30]用同样方式获得靶向丙酮酸激酶的Nb42和Nb44。在小鼠模型中，基于优化的异源二价Nb44-Nb44/ Nb42 ELISA在感染后4 d即可检测到目标抗原。

纳米抗体除了用于非洲锥虫病的检测外，也可在治疗中发挥作用。目前，控制非洲锥虫病大多使用化学疗法，但是会出现毒性强、疗效差、耐药性等问题。为了改善化学疗法的缺点，研究者设计了用于治疗非洲锥虫病的多价药物递送系统。该系统基于涂有纳米抗体NbAn33的聚乙二醇化壳聚糖纳米颗粒，可特异性识别寄生虫表面上保守的抗原决定簇，纳米颗粒中装载锥虫病药物戊烷脒[31]。该系统可以降低药物的最小治疗剂量，提高疗效，最大限度地降低毒性，并避免与表面转运蛋白突变相关的耐药性。

4 结语

近年来，抗体治疗方式受到广泛关注。相比于传统抗体分子，纳米抗体具有低分子量、低免疫原性、高溶解性和高稳定性等优点，能够使用微生物系统大量生产，靶向传统抗体到达不到的抗原表位，这大大拓展了纳米抗体应用范围。纳米抗体在针对病毒、细菌、寄生虫等引发的疫病的预防、诊断和治疗方面具有巨大的应用前景。

然而，将纳米抗体广泛应用到临床还需要克服一定障碍。纳米抗体由于分子质量小，能够迅速通过血液循环排出体外，不利于药效的发挥。目前在药物研发中，通过开发多价纳米抗体、修饰纳米抗体结构等方式可以延长药物半衰期。

现阶段，纳米抗体的低免疫原性仅在小鼠中得到证实。为了开发针对人类疾病的纳米抗体药物，需要进一步降低其免疫原性，并在临床上验证。目前，可通过设计人源化纳米抗体在一定程度上降低免疫原性。

总体来说，随着对纳米抗体的深入研究和对其局限性的克服，纳米抗体在临床治疗应用中会发挥越来越重要的作用。