山羊脑多头蚴形态学与cox1基因鉴定

段博芳，程文杰，杨 勇，赵 珍，吕 艳，姜关树，吕艳彩，杨建发，张文东*

(1.云南省动物疫病预防控制中心，云南昆明 650201；2.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；3.大理市喜洲镇农业综合服务中心，云南大理 671004)

多头带绦虫(Taeniamulticeps)属于绦虫纲(Cestoidea)、圆叶目(Cyclophyllidea)、带科(Taeniidae)、带属(Taenia)[1]。多头带绦虫中绦期幼虫脑多头蚴(Coenuruscerebralis)寄生于牛、羊等草食动物的大脑、脊髓内，可引起一种严重的人兽共患寄生虫病——脑多头蚴病(Cerebral coenurosis)，成虫寄生于犬、狼、狐等犬科动物的小肠。脑多头蚴病呈世界性分布，人体病例报道超过100例[2]。在中国多地均有报道，其中西北、华北、东北等广大牧区较为常见[3]。

线粒体基因(mitochondrial DNA，mtDNA)具有结构简单、稳定遗传、进化速度快等特点,已被应用于寄生虫分子分类、群体遗传的研究[4-6]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1，cox1)基因比较保守，适宜于寄生虫分类鉴定和系统发育分析[7-9]。

云南省已有关于山羊感染多头蚴的报道[10]。诊断方法主要依据流行病学调查、临床症状和病原学检查，云南地区脑多头蚴尚缺乏分子水平的研究。云南昭通地区存在多种优良的牛、羊品种，但缺乏对寄生虫的重视和认识，导致寄生虫感染种类多、感染情况严重，从而降低了养殖业的经济效益[11]，有必要加强昭通地区寄生虫感染情况的调查。本研究对来自云南省昭通市的山羊脑多头蚴线粒体cox1基因进行了扩增与分子鉴定，分析其cox1序列，研究其与带科带属其他绦虫的系统进化关系，以期为脑多头蚴的分子诊断提供相关参考，同时为该地区脑多头蚴病的防控提供有关资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 本研究样品来源于云南省昭通市某养殖场1只山羊的脑部。

1.1.2 主要试剂 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生物科技有限公司产品；琼脂糖粉、2×SanTaqPCR Mix 预混液(含蓝染料)，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；DNA标准DL 2 000、6×Loading buffer，TaKaRa试剂公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 光学显微镜(XS-212-105)，江南永新光学有限公司产品；恒温水浴箱(HH-W600)，深华生物技术有限公司产品；高速台式离心机(Model CF-10)，Wise Spin公司产品；PCR仪( PTC-1148)，Bibby Scientific公司产品；水平电泳仪(BG-subMINI)，BAYGENE公司产品；凝胶成像系统(WGD-30)，大韩科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学观测 将虫体置于干净的平皿中，用光学显微镜观察形态，之后将其保存于750 mL/L酒精中。

1.2.2 DNA的提取 取3个原头蚴，分别命名为ZT1、ZT2、ZT3，用ddH2O冲洗干净，将ddH2O吸干并将原头蚴分别放置于新的1.5 mL的离心管，对样品进行无菌前处理，分别加入200 μL缓冲液GA与20 μL蛋白酶K，将样品置于加热至56 ℃的水浴锅里消化过夜。按DNA提取试剂盒说明书提取样品基因组DNA，然后将其保存在-20 ℃。

1.2.3 PCR扩增 参考Bowles J等[12]扩增cox1基因的引物JB3和JB4.5。PCR扩增引物序列：上游引物JB3:5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24bp)，下游引物JB4.5: 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′( 24bp) 。预期扩增目的片段的大小约 450 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

反应扩增体系为25 μL：Mix酶12.5 μL，上、下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，超纯水10.0 μL，模板DNA为1.5 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;72 ℃延伸5 min，16 ℃反应结束。同时设阴性对照。取4 μL PCR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶电泳仪上检测，检测结果可通过紫外透射仪拍照记录。

1.2.4cox1基因序列测定及其进化分析 将PCR产物送测序公司进行测序，将测序结果进行拼接。序列拼接成功后进行Blast在线比对分析。下载GenBank中部分带属绦虫cox1基因序列(表1)。利用MEGA6.0软件构建进化树，方法为相邻法(Neighbor joining method)，以细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)作为外群，Bootstrap置信值重复抽样1 000次。用DNA Star软件MegAlign程序进行序列同源性分析。

表1 部分带属绦虫cox1基因序列信息

2 结果

2.1 形态学观察

肉眼可见许多白色、近似卵圆形的原头蚴，显微镜下观察发现头节上有4个吸盘和1个顶突，顶突上有小钩(图1)。根据观察结果，结合寄生部位，初步推断为脑多头蚴。

a.原头蚴(40×)；b.头节(100×)

2.2 PCR扩增结果

3个脑多头蚴样品均成功扩增出cox1基因片段，与预期目的片段长度相符，PCR产物电泳结果见图2。

2.3 cox1基因测序与序列分析结果

样品cox1基因片段长度为446 bp，与GenBank收录的多头带绦虫分离株(登录号:KR604808.1)的同源性均高于99.1%。DNAMAN软件进行分析，发现3个脑多头蚴样品一致性为99.85%，其中ZT1分离株和ZT3分离株序列完全一致，共得到2个不同的序列，cox1序列的A、T、C、G碱基的平均含量分别为22.65%、45.14%、10.31%、21.90%，序列中A+T的含量(67.79%)远高于G+C的含量(32.21%)，2个位点发生碱基突变(C/T位于436，G/C位于437)。DNA Star软件MegAlign程序分析3例样品的同源性为100.0%，与带科带属其他绦虫同源性为88.2%～94.5%，与带属其他多头带绦虫同源性为97.2%～100.0%，其中与中国甘肃、中国青海等国内分离株同源性为97.2%～100.0%。

基于cox1基因构建的系统发育树显示所有多头带绦虫分离株以85%的置信度汇成一支，本研究中的云南分离株与伊朗、中国攀枝花、希腊等分离株亲缘关系较近，而与中国甘肃、中国青海、埃及等多个地区的分离株亲缘关系较远。分离株没有按照同一地区或宿主而相应聚成一个分支(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～3.ZT1,ZT2,ZT3；4.阴性对照

图3 cox1基因片段进化树分析

3 讨论

形态学观察是鉴定寄生虫的重要手段，但是此种方法存在局限性，也有可能出现同种异名的情况。分子检测为寄生虫的快速鉴定及分类提供了强有力的支持。云南地区目前已有黑山羊感染多头蚴的报道[10]，诊断依据主要为临床症状和病原学检查。本研究在形态学观察的基础上利用cox1基因作为分子标记鉴定山羊感染了多头带绦虫幼虫——脑多头蚴，通过分子检测确定云南地区在山羊之中存在脑多头蚴的流行。进化树显示，多头带绦虫与带科带属其他绦虫形成不同的分支，表明cox1基因可以作为一种有效的分子标记用于多头带绦虫的鉴定及带科绦虫的分类研究。本研究中脑多头蚴分离株cox1基因序列存在差异，表明发生变异或可能存在不同的基因型，这与Zhang Y等[13]研究发现脑多头蚴在cox1基因处发生遗传变异较为常见相符合。

多头蚴曾根据寄生部位不同而被分为脑多头蚴、格氏多头蚴和斯氏多头蚴[14]。之后的研究表明格氏多头绦虫和多头带绦虫为同一个种[15-16]。在进化树中，多头带绦虫分离株并未按照寄生部位聚类，伊朗格氏多头蚴分离株(HM101469.1)与其他多头带绦虫分离株相聚共同形成了一个大分支，表明格氏多头蚴是多头带绦虫的同种异名，与郝桂英等[17]的研究结论相同。分离株也未按照牛、羊等宿主或者地区进行聚类。

世界多地均有羊感染脑多头蚴的报道。于合宅[18]调查发现河北省部分地区山羊脑多头蚴感染率为2.38%，同时调查范围内犬的多头带绦虫感染率达15.33%。李连芳[19]报道了青海省多个地区羊多头蚴病发病率平均为1.44%，病死率为47.65%，其中海晏地区病死率高达89.50%。意大利屠宰绵羊中脑多头蚴的感染率为0.35%[20]。约旦屠宰绵羊中脑多头蚴的感染率为2.66%[21]。脑多头蚴病可引起神经系统疾病，严重者甚至会造成羊死亡，给养羊业造成巨大的经济损失。针对患病羊，可以通过手术进行治疗[22]，也可选用吡喹酮等药物进行治疗[23]。昭通地区曾存在多种绦虫的流行，且犬与绦虫的流行存在密切的联系[24]，防治脑多头蚴病需加强对犬的控制。可对犬进行定期驱虫，并及时无害化处理粪便。据孙丽仙等[10]报道，云南会泽地区有19头黑山羊感染多头蚴，但云南地区山羊脑多头蚴的感染状况、分布状况、分子生物学流行特点等基础数据不详，此研究为进一步开展云南省山羊脑多头蚴的流行病学调查提供了基础数据。