2，4-表油菜素内酯对多菌灵处理下葡萄抗氧化代谢系统的影响

孙嘉华，李雨萌,凌 翰,惠竹梅

(西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100)

我国大多数地区属于大陆性季风气候，雨热同季。在黄河故道、环渤海湾、黄土高原等主要葡萄种植区域，夏秋多雨容易导致葡萄霜霉病、白腐病、炭疽病等真菌病害频繁发生，因此，在葡萄栽培管理中常使用杀菌剂、杀虫剂等化学农药来防治真菌病害[1]。多菌灵是葡萄田间管理中广泛使用的一种高效低毒杀菌剂，它属于苯并咪唑类农药，对许多子囊菌和半知菌有效，可干扰细菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂，从而起到杀菌作用，常用于葡萄白腐病、黑痘病、炭疽病的防治[2]。但在葡萄栽培管理中经常因为农药使用不当，使大量有机物残留在葡萄植株上，导致葡萄叶片萎黄、光合能力降低、营养物质缺乏以及生物量减少[3]，残留的农药还会进入葡萄果实或通过发酵进入葡萄酒中影响葡萄酒的质量安全，对人类健康造成威胁[1]。植物在长期进化中形成了自身的解毒机制，它们将农药代谢为毒性较低的物质隔离储存起来从而达到解毒的目的，但由于植物自身解毒机制效率较低，所以需要通过物理、化学和生物手段加速农药残留的降解[3]。油菜素内酯可参与植物体内多种生长代谢和抗逆过程，在降解农药残留方面有着较好的应用前景。

油菜素内酯 (Brassinosteroid, 简称BR)是广泛存在于植物中的甾醇类激素，它在植物生长发育中起到至关重要的作用，可以缓解多种生物胁迫和非生物胁迫。已有研究表明：0.1 mg·L-1的外源2，4-表油菜素内酯(EBR)预处理能通过改善葡萄叶片光合特性，减少其活性氧物质和丙二醛(MDA)的积累以及提高解毒酶活性以促进百菌清降解，从而缓解农药对葡萄植株的伤害[3]；当葡萄遭受低温胁迫时，外源BRs可通过提高植物体内的保护酶活性、清除活性氧自由基而间接抑制过氧化产物MDA的含量，从而减轻低温诱导的氧化性损伤[4]；EBR预处理能够通过提高黄瓜幼苗叶片的同化能力和抗氧化酶活性缓解多种农药的药害[5]；在番茄、黄瓜等作物上喷洒多菌灵、毒死蜱和除虫菊酯等农药前，先喷洒少量油菜素内酯作预处理，可以降低农药残留30%～70%[6]；对植物用毒死蜱处理前先用EBR预处理可提高植物体内的谷胱甘肽S-转移酶(GST)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性，从而能够降低农药残留[7]。有关外源EBR对农药多菌灵(CBD)胁迫下葡萄植株抗氧化系统的影响尚少见研究报道。本试验以欧亚种酿酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)为试材，研究EBR预处理对CBD胁迫下葡萄植株抗氧化系统的影响，以期明确外源EBR对CBD胁迫下葡萄植株的生理调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年在陕西杨凌西北农林科技大学葡萄酒学院日光温室及中心实验室进行，供试品种为欧亚种酿酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)2 a生葡萄盆栽苗。2017年6月进行塑料盆扦插育苗，盆高18 cm、盆口外径26 cm、盆口内径24 cm、盆底直径14 cm，盆中营养土重量约5 kg，营养土配方为原土(V)∶珍珠岩(V)∶腐殖质(V)=2∶1∶1。2017年12月移至西北农林科技大学杨凌区试验农场温室中进行正常管理。2018年4月中旬当赤霞珠葡萄盆栽苗生长至10～12片完全展开叶时，选择生长状况基本一致的盆栽苗进行试验处理。

EBR购自加拿大TRC公司；多菌灵可湿性粉剂(50%)购自四川国光农化股份有限公司。

1.2 试验设计

本试验共设CK、稀释800倍CBD、0.3 mg·L-1EBR+稀释800倍CBD 3种处理，每种处理3个重复，每个重复5株葡萄苗。试剂使用浓度和采样时间根据课题组关于EBR处理对葡萄盆栽苗的影响研究而定[3, 8]。喷施前EBR和CBD都先用98%的乙醇溶解，再稀释到试验设置浓度，并使乙醇最终含量为0.1%(v/v)，同时加入终浓度0.1%(v/v)的吐温-80，配好的EBR溶液和CBD溶液避光冷藏保存。清水中也加入同样体积的98%乙醇和吐温-80。试验选在晴朗、无风且日照较弱的下午进行，首先分别对CK、CBD与EBR+CBD处理组葡萄盆栽苗叶片喷施清水、清水、0.3 mg·L-1EBR，间隔24 h后再分别对上述各处理组葡萄盆栽苗叶片喷施清水、稀释800倍CBD、稀释800倍CBD。各处理用容量0.8 L的喷壶喷施葡萄盆栽苗所有叶片的正、反两面，以叶面滴水为止。记多菌灵处理当天为第0天，分别在多菌灵处理后的第1、3、5、7、9天采样，每株葡萄苗选取其2～6节位长势相同的叶片随机采样，采集的叶片去除主叶脉后剪成细丝状，每个样品混合均匀后放入-40℃冰箱中保存备用，用于各项指标的测定。

1.3 测定指标与方法

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel和SPSS数据分析软件进行统计分析，并用邓肯氏法进行多重比较，对于同一个测定指标，分析同一时间点上3个处理之间的差异显著性，用不同小写字母表示(P<0.05)，图中的短线代表标准误。

2 结果与分析

2.1 EBR对CBD处理下葡萄叶片含量的影响

2.2 EBR对CBD处理下葡萄叶片GSH和AsA含量的影响

从图2可以看出，CBD处理的葡萄叶片GSH含量与对照相比无显著变化；与CBD处理相比，除第1天和第9天外，EBR+CBD处理使葡萄叶片GSH含量显著升高，平均比CBD处理升高5.46%。

在整个处理过程中，与对照相比，CBD处理使葡萄叶片AsA含量略微升高，平均比对照升高2.52%；与CBD处理相比，除第1天外，EBR+CBD处理使葡萄叶片AsA含量显著升高，平均比CBD处理升高24.92%。说明0.3 mg·L-1EBR预处理可显著提高农药胁迫下葡萄叶片的抗氧化物质含量，提高葡萄盆栽苗对农药的抗性。

2.3 EBR对CBD处理下葡萄叶片抗氧化酶活性的影响

由图3可以看出，在整个处理过程中，与对照相比，CBD处理使葡萄叶片CAT、POD活性显著增强；除第1天和第9天外，CBD处理使葡萄叶片GR活性显著高于对照；与CBD处理相比，EBR+CBD处理使葡萄叶片CAT、GR活性分别在处理5天后和处理3～7 d显著增强，平均比CBD处理分别升高17.15%、5.33%；除第7天外，EBR+CBD处理与CBD处理的葡萄叶片POD活性均无显著差异。该结果表明0.3 mg·L-1EBR预处理主要通过增加抗氧化酶CAT、GR的活性来有效增强葡萄盆栽苗对农药多菌灵的抗性，但对POD的活性影响不显著。

3 讨 论

3.1 外源EBR处理降低CBD胁迫下葡萄活性氧类物质含量

3.2 外源EBR处理提高CBD胁迫下葡萄叶片抗氧化物质含量

植物体内ROS的清除主要依靠两套抗氧化系统：一类是抗氧化物质, 另一类是抗氧化酶系统[17]。GSH和AsA是植物体内重要的抗氧化物质，它们能够与ROS反应直接清除ROS或作为抗氧化酶的底物间接清除ROS[8]，从而降低植物细胞内活性氧自由基的含量，避免过多的ROS物质对植物造成伤害。已有研究表明外源EBR处理可以提高农药百菌清[3]、低温[4]等非生物胁迫下葡萄抗氧化物质GSH和AsA的含量，提高葡萄植株的抗性。本试验中用稀释800倍的CBD处理使葡萄盆栽苗叶片中GSH和AsA的含量升高，可能因为该浓度的农药刺激了葡萄体内的防御机制，从而产生更多的保护物质。EBR预处理后进一步提高了葡萄叶片中GSH和AsA的含量，这与吴雪霞[15]、彭小琴[3]等的研究一致，说明外源EBR可以通过提高葡萄盆栽苗叶片内抗氧化物质GSH和AsA的含量而增强其对农药胁迫的抗性。

3.3 外源EBR处理提高CBD胁迫下葡萄叶片抗氧化酶活性

抗氧化酶系统是植物遭受环境胁迫时重要的防御系统，CAT、POD和GR是植物体内主要的抗氧化酶，POD与CAT共同作用消除植物细胞内过多H2O2，GR活性的增强促进抗氧化物质GSH含量的升高[18]，它们之间的协同作用可以防止活性氧自由基对细胞膜造成伤害, 抑制膜脂过氧化, 减轻逆境胁迫对植物的伤害[19-20]。寇江涛等[21]研究表明，外源EBR可显著增加NaCl盐胁迫下紫花苜蓿幼苗根系的抗氧化酶活性；在低温胁迫下，外源EBR处理可显著增强葡萄幼苗的抗氧化酶活性[4]，提高植物的抗性。本试验中CBD处理使葡萄叶片抗氧化酶CAT、POD、GR活性显著增强，可能经稀释800倍的CBD处理刺激了葡萄盆栽苗的应激保护功能，通过提高抗氧化酶的活性保护细胞免受氧化损害；与单独CBD处理相比，EBR+CBD处理进一步增强了抗氧化酶CAT、GR的活性，但对POD活性作用效果不明显，说明EBR预处理可能主要通过增加葡萄抗氧化酶CAT、GR的活性来有效增强葡萄盆栽苗对农药多菌灵的抗性。

4 结 论