TLR-MyD88-NF-κB信号通路在支原体肺炎模型小鼠肺部炎症损伤中的作用及其机制

王振虹 姜永杰 徐雷 王冲 曲政海 郭沙沙，4

(1 青岛大学附属医院教育培训部，山东 青岛 266003； 2 青岛市西海岸新区中心医院儿科；3 青岛大学附属医院儿科； 4 贵州省人民医院)

儿童和青少年社区获得性肺炎高达40%是由肺炎支原体(MP)感染所导致[1]，儿童以及青少年为易感的人群[2]。MP肺炎可以导致急性呼吸窘迫综合征[3]，少数可以发展成为重症，严重威胁到儿童健康[4]。由MP引起的呼吸道疾病包括细支气管炎、支气管炎、闭塞性细支气管炎和支气管扩张等。近年来研究显示，MP感染还可以引起儿童哮喘[5]。Toll样受体(TLRs)作为模式识别受体，可以和病原体表面配体相结合，激活人体先天性免疫系统，对病原体微生物起到非特异性免疫作用，同时在特异性免疫应答中也起到重要的作用。近年来，动物实验证实，TLRs在多种病原体感染相关实验模型中表达水平均明显升高[6]。TLRs、髓样分化因子88(MyD88)与核转录因子κB(NF-κB)组成的信号通路在多种疾病发病及治疗过程中发挥重要作用[7]。本研究在支原体肺炎(MPP)小鼠动物模型基础上，探讨TLR-MyD88-NF-κB信号通路在MPP发病中相关作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组

健康SPF级BALB/c小鼠60只，雌雄各半，体质量14～18 g， 4～6周龄，置于青岛大学附属医院动物实验中心SPF级动物房中进行饲养，室温控制在20～22 ℃，相对湿度60%～70%，12-12 h昼夜循环环境。由即墨市动物饲养所提供。MP血清学检测呈阴性。按照数字表法将小鼠随机分为MPP组(40只)和对照组(20只)。

1.2 材料和设备

MP(ATCC15331)FH 型标准株(上海佰泰科技有限公司)，IL-4、IL-6 ELISA试剂盒(美国R&D公司)，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65山羊抗兔单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。高速低温离心机(美国Thermo公司)，RM2015型石蜡切片机(德国Leica公司)，BX51T-PHD-J11型显微镜(日本Olympus公司)，Roche Bench Mark XT染色机(瑞士Roche公司)。

1.3 MPP动物模型制备

MPP组参照文献[8]中的方法制备MPP小鼠模型。使用体积分数0.10的水合氯醛麻醉小鼠后，将小鼠头后仰30°～45°，将浓度为1010ccu/L的MP菌液0.1 mL滴入MPP组每只小鼠鼻腔，使菌液自鼻腔随着呼吸自然流入下呼吸道，连续3 d；对照组小鼠以用等量的生理盐水滴鼻，连续3 d。滴鼻后每天观察两组小鼠的精神状态、活动度、饮食量、饮水次数及口鼻分泌物等情况变化。感染后第7天，观察两组小鼠临床症状，记录体质量。每组随机挑选2只小鼠麻醉以后摘眼球采集血标本0.5 mL，静置15 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，后严格按照MP核酸检测试剂盒说明书进行MP检测，MP检测阳性说明造模成功[9]。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)制备

造模成功后，以水合氯醛快速麻醉小鼠后，行颈部手术分离气管并插管，然后以0.5 mL PBS灌洗肺腔3次，收集BALF,并于-40 ℃储存备用，其回收率约可达到70%。

1.5 两组小鼠BALF中IL-4、IL-6水平的测定

采用ELISA方法测定两组小鼠BALF中IL-4、IL-6的水平，检测步骤按照试剂盒说明书进行。

1.6 肺组织切片及HE染色

同上法麻醉小鼠后，打开胸腔，取出肺组织，采用称质量法并按照公式(肺脏质量/体质量×100%)计算湿肺质量指数。后用40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定12 h。常规石蜡包埋，连续5 μm厚切片，切片按常规脱蜡入水，以苏木精染色7 min，后伊红染色4 min，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，以中性树胶封片，然后置于光镜下观察肺组织病理变化情况。

1.7 免疫组化法检测小鼠肺组织中TLR2、TLR4、MyD88与NF-κB p65的表达

肺组织切片常规脱蜡，配置枸橼酸修复液，高压5 min进行抗原修复；以过氧化氢溶液37 ℃避光孵育20 min以去除内源性过氧化物酶；山羊血清于37 ℃孵育60 min；滴加抗TLR2、TLR4、MyD88与NF-κB p65抗体(1∶200稀释)，4 ℃过夜；二抗室温孵育30 min；三抗室温孵育30 min；DAB显色，蒸馏水终止显色；苏木精复染，体积分数0.01盐酸乙醇分化，氨水返蓝，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察及拍照。光镜下每标本随机选取5个视野并采集图像，使用Image-ProPlus系统对图片进行分析，得到每个视野的吸光度(A)值，并计算每标本5个视野平均吸光度值的平均值。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 小鼠的一般状况及MPP组小鼠建模情况

实验第7天，对照组小鼠较为活泼，精神食欲良好，体质量增长良好。MPP组小鼠精神萎靡、活动减少、竖毛、寒战、挠鼻，并出现生长抑制现象，且小鼠MP核酸检测阳性，说明造模成功。

2.2 两组小鼠肺组织观察

对照组小鼠肺泡结构均匀清晰，肺泡内无渗出物，偶尔可见淋巴细胞和巨噬细胞浸润，主要分布在支气管、血管周围及肺泡间隔附近(图1A、B)。 MPP组小鼠气管支气管周围及管腔内以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，血管周围以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，肺泡结构破坏，肺泡内可见较多渗出物，肺泡间质明显增宽，在支气管和血管周围及肺泡间质中有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图1C、D)。

A：对照组小鼠肺组织切片，HE染色，25倍；B：对照组小鼠肺组织切片，HE染色，400倍；C：MPP组小鼠肺组织病理切片，HE染色，25倍；D：MPP组小鼠肺组织病理切片，HE染色，400倍

2.3 两组小鼠湿肺质量指数和BALF中IL-4、IL-6水平的变化情况

MPP组小鼠的湿肺质量指数明显高于对照组(t=316.03,P<0.01)。MPP组BALF中IL-4、IL-6表达水平均明显高于对照组(t=7.46、33.97，P<0.01)。见表1。

表1 两组小鼠湿肺质量指数以及BALF中IL-4、IL-6水平比较

2.4 两组小鼠的肺组织中TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB p65表达水平比较

MPP组小鼠肺组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表达水平均明显高于对照组(t=7.95～11.70，P<0.01)。见表2。

表2 两组小鼠肺组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBP65表达水平

2.5 MPP组小鼠的肺组织中MyD88与TLR2、TLR4、NF-κBP65表达的相关性

MPP组小鼠肺组织中，TLR2和MYD88蛋白表达均阳性22例，均阴性14例，TLR4和MYD88蛋白表达均阳性23例，均阴性12例，Pearson相关分析显示，MPP组小鼠肺组织中MyD88与TLR2、TLR4、NF-κB表达均呈正相关(r=0.554～0.622，P<0.01)。

3 讨 论

MPP是一种儿童常见的社区获得性呼吸道感染性疾病[10]，可引起较重的发热、咳嗽、气促以及肺功能降低等临床症状，重症支原体感染可引起肺外的一些并发症[11]，治疗难度加大，治疗费用较高。MPP发病机制目前研究主要集中于病原微生物感染直接导致气道黏膜损伤及免疫损伤，其中免疫损伤及相关信号通路研究是目前热点[12]。

TLRs是一类重要的细胞膜和胞内受体，可识别多种微生物大分子[13]。研究显示TLRs会募集MyD88，然后通过一系列信号传导，促使中性粒细胞聚集、巨噬细胞活化、产生特异性抗体，以抵御入侵的病原体[14]。TLRs在抗原提呈细胞表面的表达丰富，不同的TLRs分子可以对各类病原体以及病原体产物的特殊蛋白结构做出识别，迅速启动人体的先天性免疫系统，激活固有免疫系统，从而使人类具有先天性抗病原感染的能力[15]。

TLRs的信号转导通路需要多种信号蛋白的参与，MyD88依赖型和MyD88非依赖型/TRIF依赖型信号通路是主要2条信号传导通路[16]。MyD88是TLRs介导先天免疫反应的重要接头蛋白，可以激活下游信号通路中NF-κB，最终引起炎症递质和细胞因子的释放[17]。

TLR2和TLR4在MP感染中可以诱导机体对MP产生适当的免疫反应，并可诱发MP相关并发症如气道高反应性[18]。研究显示，MP感染可通过TLR信号通路加重对机体的免疫损伤[19]。本研究结果亦显示，MyD88与TLR4、NF-κB的表达呈正相关，从而证实TLR4是通过MyD88依赖途径进行信号传递，MyD88通过募集IL-1受体相关激酶(IRAK)1、IRAK4、TRAF6等信号分子，使NF-κB活化，引起炎性细胞因子释放，进而导致气道黏膜免疫损伤。说明TLR-MyD88-NF-κB是重要的信号传导通路，在机体非特异性和特异性免疫应答反应中均起到重要作用，该通路能调节机体多种免疫效应蛋白和炎症因子的表达[20]。

本研究目的是采用MP感染小鼠模型来重现人MP感染过程，探讨MP感染后TLR-MyD88-NF-κB信号通路在诱导肺部炎症中的作用机制。本研究结果显示，光镜下MPP组小鼠肺组织可见大量淋巴细胞以及巨噬细胞等炎症细胞浸润，BALF中IL-4、IL-6等细胞因子表达水平明显升高，肺组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表达水平明显高于对照组。另外，TLR4、TLR2表达量与转接蛋白MyD88及NF-κB表达量呈正相关。推测MP感染可致TLR2、TLR4表达水平升高，活化MyD88-NF-κB信号通路，诱导多种炎症因子产生，其中以IL-4、IL-6等细胞因子为著，导致局部过度炎症反应，破坏肺泡结构，同时诱导气道黏液高分泌，进一步加重肺损伤。

综上所述，MP感染可能是通过TLR-MyD88-NF-κB信号通路的活化，诱导机体产生炎性肺损伤，并参与MP感染后的气道黏膜的免疫损伤。