过表达LHPP对人胆管癌细胞增殖的作用及机制*

宋春灼， 李想， 李俊俊， 刘猛， 付立跃， 朱海涛1，***

(1.贵州医科大学附属医院 肝胆外科， 贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 临床医学院， 贵州 贵阳 550004)

胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是胆管上皮来源的恶性肿瘤，在原发性肝脏恶性肿瘤中排第二位[1]。根治性手术切除是目前CCA患者可能获得长期生存的最佳治疗手段[2]。但由于CCA患者早期无特异性临床症状，大多数患者在明确诊断时已丧失手术机会[3]，因此，明确CCA在发生发展过程中的分子机制将对该病的早期诊断及临床治疗大有裨益。磷脂磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP)是在牛肝组织中发现的一种磷酸酶[4]，有研究表明LHPP在肝癌、膀胱癌、宫颈癌和胰腺癌等多种实体恶性肿瘤中发挥抑癌作用[5-8]，而LHPP在CCA中的作用却少见报道。因此，本研究通过在CCA细胞中过表达LHPP基因，观察其对CCA细胞增殖能力的影响并探究其可能机制，为CCA的临床治疗策略提供理论基础。

实践中，许多自由贸易协定内包含有规定自贸园区货物在自由贸易协定下如何对待的特殊条款。通常，自由贸易协定限制或禁止来源于成员国自贸园区安排下的货物享有自由贸易协定的内部优惠关税，换言之，自由贸易协定中的自贸园区特殊条款将自贸园区货物视为区域外产品，并应服从区域统一外部关税安排。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 人正常肝内胆管上皮细胞株HIBEpiC购于中国科学院细胞库，CCA细胞株TFK-1、HuCCT-1由华中科技大学附属同济医院胆胰实验室惠赠。

1.1.2主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基、含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶溶液(美国Gibco)，胎牛血清(以色列BI)，1%青霉素/链霉素双抗溶液(美国Corning)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(上海Dojido)，聚凝胺(polybrene)、5×蛋白上样缓冲液(5×loading buffer)及嘌呤霉素(北京Solarbio)，RIPA裂解液、4%多聚甲醛及0.01%结晶紫(广州Affinity)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ,GAPDH)、鼠抗人蛋白激酶B(protein kinase B ,AKT)、兔抗人抑癌基因(human tumor suppressor gene，P53)及兔抗人LHPP单克隆抗体(武汉Proteintech Group)，兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B ,p-AKT)单克隆抗体(美国CST)，羊抗兔/鼠二抗(武汉Boster)，慢病毒包装由上海吉满生物公司完成；371型恒温细胞培养箱和多功能酶标仪(美国Thermo)，普通离心机(德国Heraeus)，普通倒置显微镜(日本Nikon)，电泳仪和摇床仪(北京六一生物)。

推动党风廉政建设与企业经营管理深度融合，切实规范国有企业领导人员廉洁从业行为，架起制度的“高压线”，堵住国资可能的“出血点”，才能推动国有企业持续健康发展。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及慢病毒感染 所有细胞株均培养在RPMI-1640培养基中，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液，细胞放在培养箱中(37 ℃、5%CO2)培养。在TFK-1和HuCCT-1细胞中分别用过表达LHPP慢病毒载体及其空白对照慢病毒载体进行感染，将细胞分为过表达LHPP组(LHPP组)和对照组(NC组)。10 mmol/L polybrene感染48 h，用2 mmol/L嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株。

1.2.2细胞增殖实验 采用CCK-8法，分别收集2种CCA细胞的LHPP组和NC组细胞，胰酶消化并计数，按3×103个/孔细胞接种在96孔板中，每组设置5个复孔，细胞接种6 h测定为0 h的细胞活力，然后分别于24、48及72 h测定细胞活力；测定时吸出原培养基，向每孔中加预先配置的含CCK-8溶液110 μL(无血清RPMI-1640培养基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10)，置于培养箱孵育2 h，于酶标仪450 nm处测量吸光度(optical density，OD)值并绘制生长曲线。

CCK-8实验结果显示， LHPP组TFK-1和HuCCT-1细胞于48 和72 h时OD值均较NC组减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

Western blot检测结果表明， LHPP组TFK-1和HuCCT-1细胞中LHPP蛋白表达量均较NC组增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

1.3 统计学分析

1.2.4Western blot分析 收集状态良好的各组待测细胞，RIPA裂解液于冰上裂解 30 min；超声破碎10 s，12 000 r/min于 4℃离心10 min，收集上清蛋白液；加适量5×loading buffer于蛋白样品中，100 ℃变性10 min；取蛋白50 μg上样，10%丙烯酰胺凝胶经100 V恒压电泳2 h，250 mA恒流电转90 min，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)溶液在常温下封闭2 h；按目的蛋白分子量裁剪PVDF膜，并将PVDF膜置于稀释度为 1 ∶1 000 的一抗(兔抗人GAPDH、鼠抗人AKT、兔抗人p-AKT、兔抗人P53及兔抗人LHPP单克隆抗体)中，4 ℃孵育过夜，洗涤缓冲液(tris buffered saline tween，TBST) 洗涤3次，再与相应二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h，滴加超敏曝光液检测蛋白质。

2 结果

2.1 LHPP的表达

这位来自波恩的维也纳艺术家，“所有艺术都属于他，属于他那彻底直接的艺术作品。他是个有血有肉的人，从各方面来看都是个伟人。……他曾活在世上，如今死去，却将永生。”

注：A为细胞株LHPP蛋白图，B为LHPP相对表达量；(1)与HIBEpiC细胞比较，P<0.05。

2.2 CCA细胞中过表达LHPP

1.2.3细胞克隆 取对数生长期的各组细胞，计数调整细胞浓度，在6孔板中种植1×103个/孔细胞；待14 d后吸去皿里的培养基，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，拍照记录并计算各组的克隆数。

Western blot检测结果表明，与人正常肝内胆管上皮细胞HIBEpiC相比，人CCA细胞株TFK-1、HuCCT-1细胞中LHPP蛋白表达量均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为Western blot结果，B为LHPP相对表达量；(1)与NC组比较，P<0.05。

2.3 CCK-8实验

在孙中山先生眼中，西南铁路系统建设意义重大。是“西南各省全部之繁荣为最有用者也”，“种种丰富之矿产可以开发，而城镇亦可于沿途建之”。但孙中山先生也看到，西南铁路建设难度极大。“西南地方，地皆险峻。”“此诸地者，非山即谷。”“故建此诸铁路之工程上困难，比之西北平原铁路系统，乃至数倍。多数之隧道与凿山路，须行开凿，故建筑之费，此诸路当为中国各路之冠。”

注：A为TFK-1细胞，B为HuCCT-1细胞；(1)与同时点NC组比较，P<0.05。

2.4 细胞克隆

Western blot结果显示，与NC组相比，LHPP组TFK-1和HuCCT-1细胞中总AKT蛋白表达无明显改变，但p-AKT蛋白表达相对下降、P53蛋白表达则增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：A为细胞克隆形成，B为细胞克隆数定量表达；(1)与NC组比较，P<0.05。

2.5 AKT、p-AKT及P53蛋白的表达

克隆形成实验结果显示，LHPP组TFK-1和HuCCT-1细胞的克隆形成能力均较NC组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为Western blot结果，B、C及D分别为AKT、p-AKT及P53相对表达量；(1)与NC组比较，P<0.05。

3 讨论

CCA具有发病隐匿、早期诊断困难、恶性程度高及预后不良等特点，是腹腔难治性恶性肿瘤之一[9-10]。在我国，CCA患者手术切除后1、3及5年生存率仅分别为71.7%、38.2%及10.9%[11]。这意味着，探索CCA发生的新的分子机制将对CCA的临床诊断及治疗尤为重要。

在对话教学过程中，要改变传统的教学方式。如问答式对话教学——以教师为中心和启发式对话教学——以学生为中心，转变为交互式对话教学——以双主体为中心，使教师和学生之间成为一种平等的对话关系，对于知识的把握只存在时间上的差别。

LHPP基因是卤醇脱卤酶HAD(haloacid dehalogenas)超家族的成员之一，位于人类10号染色体(10q26.13)上，由7个外显子编码构成3个亮氨酸拉链样结构域，能剪接产生9个转录变体[12]。LHPP可以有效水解焦磷酸中的氧-磷键、以及亚氨基二磷酸、3-磷酸组氨酸和6-磷酸赖氨酸中的氮-磷键，在参与调控信号转导及细胞生长、分化等过程中发挥重要作用[4,13-15]。最近，许多独立的全基因组关联研究(genome wide association study，GWAS)将LHPP确定为癌症相关风险基因，如LHPP变异体(LHPP rs201982221)是口腔癌和咽癌的新风险基因[16]，LHPP变异体(LHPP rs35837782)被认为是B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL)的常见风险基因[17]，内含子LHPP单核苷酸多态性(rs61408740)被鉴定为睾丸生殖细胞肿瘤易感性相关的8个新风险基因之一[18]。另外，同样有研究表明LHPP参与调控肿瘤发生发展的过程，Hindupur 等[19]研究证明了LHPP在肝癌组织中低表达，且低LHPP表达水平也预示着肿瘤严重程度和总生存率降低，LHPP可能是一种新的人类抑癌因子。之后不断有文献报道了LHPP作为肿瘤抑制因子参与调控膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌及肾癌等恶性肿瘤的发展过程[6-8,20]。由此可见，LHPP与肿瘤的相关性及其在肿瘤中发挥的作用值得进一步研究。

本研究结果首先表明LHPP在CCA细胞中的表达降低，通过在低表达的TFK-1和HuCCT-1细胞中过表达LHPP，CCK-8实验结果显示在过表达LHPP的CCA细胞中，48和72 h时所测得OD值较NC组细胞低；克隆形成实验结果同样显示，在CCA细胞中过表达LHPP后，细胞的克隆形成能力减弱。这些结果提示，过表达LHPP能抑制CCA细胞的增殖能力。

AKT信号通路的级联反应改变在癌症细胞的增殖、凋亡及转移等过程中发挥了重要作用，例如，AKT信号通路激活促进结直肠癌的转移进程，而AKT通路的失活是诱导人乳腺癌细胞凋亡的关键[21-22]。本研究结果表明，在过表达LHPP的CCA细胞中，p-AKT蛋白表达下调，AKT蛋白表达无明显改变，这似乎提示LHPP可能通过调节p-AKT的表达而参与调控CCA细胞的增殖作用。抑癌基因功能缺失是癌症发生的重要机制，其中，抑癌基因P53功能缺失是人类癌症中最常见的基因事件，P53突变是包括CCA在内的多种癌症发生的重要过程[23-25]。本研究通过对不同组CCA细胞中P53蛋白进行检测发现，在过表达LHPP的CCA细胞中P53蛋白表达增加，这表明，LHPP可能通过促进P53表达而发挥抑制CCA细胞的增殖作用。

综上所述，在CCA细胞中，过表达LHPP能抑制细胞的增殖作用，其发生机制可能与下调p-AKT蛋白表达和上调P53蛋白表达有关。但本研究仅局限在体外探讨了LHPP对CCA细胞的增殖作用及机制，对于在机体内复杂因素影响下，LHPP在CCA中的作用及机制仍有待进一步研究，LHPP有望成为治疗CCA新的作用靶点。