移植卒中患者肠道菌群后大鼠血清同型半胱氨酸变化对抑郁障碍的影响及机制*

妙炜， 段昌嵘， 谢雨萌， 郑蕾*

(贵州医科大学附属医院 精神科， 贵州 贵阳 550004)

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是单病种致残率最高的疾病[1]。卒中后抑郁(post-stroke-depression，PSD)是脑卒中后常见的一种并发症,不仅降低了脑卒中患者的生活质量、进一步增加了脑卒中患者的死亡率[2-3]。卒中后抑郁的机制复杂，包括社会心理因素和生物学因素两个方面[4]；近期研究发现卒中所导致的肠道菌群紊乱与抑郁密切相关[5]，调节肠道菌群紊乱可以在一定程度上改善患者的抑郁状态[6-7]。值得注意的是，卒中后抑郁患者同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)会异常增高，这可能影响单胺类神经递质的合成，导致抑郁症状的出现[8-9]。研究发现，肠道菌群紊乱将导致叶酸(folic acid，FA)、维生素B12(vitamin B12，VB12)降低，FA和VB12是Hcy代谢的重要原料，缺乏FA和VB12可导致Hcy无法被蛋氨酸合成酶和亚甲基四氢叶酸还原酶再甲基化为蛋氨酸和四氢叶酸，可能最终导致了Hcy水平增高[10]。基于上述研究，本研究通过向大鼠体内移植卒中患者紊乱的肠道菌群，采用16S测序技术测定大鼠粪便中所含细菌的优势菌群变化情况，同时检测大鼠体内Hcy、FA和VB12水平，以验证卒中后肠道菌群紊乱对大鼠抑郁症状的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物与分组 选取SPF级健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠40只，体质量250～300 g，购买于贵州医科大学实验动物中心[合格证号SYXK(黔)2018-0001]，饲养于贵州医科大学实验动物中心1周适应环境，正常昼夜节律，自由摄食饮水，室温(21±2)℃。本实验操作流程经学校伦理委员会审批通过(编号1901085)。SD大鼠40只，随机均分为实验组(移植卒中患者肠道菌群+慢性应激刺激)、益生菌保护组(移植卒中患者肠道菌群+慢性应激刺激+口服益生菌)、对照组(移植正常人肠道菌群+慢性应激刺激)及空白组(仅移植正常人肠道菌群)；空白组每笼饲养10只，其他组采用分养法，每笼1只(孤养)。

1.1.2药物和试剂 盐酸环丙沙星(哈药三精，批号1812003)，青霉素V钾片(重庆科瑞，批号429001)，法罗培南钠胶囊(上海衡山，批号180901)，甲硝唑片(山东鲁西，批号20180802)，双歧杆菌四联活菌片(杭州远大，批号S20060010)，大鼠叶酸(FA)酶联免疫分析(上海广锐，货号ER511)，维生素B12(VB12)酶联免疫分析(上海广锐，货号ER2017)，同型半胱氨酸(Hcy)酶联免疫分析(上海广锐，货号ER2285)，粪便DNA提取试剂盒(QIAamp)。

1.2 实验方法

1.2.1卒中患者和正常健康人肠道菌群灌注液制备 所选3例脑卒中患者符合第四届全国脑血管病学术会议修订的缺血性卒中诊断标准[11]，发病至少1周以上，年龄40～65岁，既往无精神疾病及其他慢性疾病史，无长期药物使用史，近6周内无肠道疾病及使用抗生素药物史；使用无菌盒采集患者清晨中段粪便约20 g，迅速送至实验室加无菌注射用水20 mL混匀，双层纱布过滤，静置，将过滤后的样本以6 000 r/min(离心半径为13.5 cm)离心15 min，将沉淀物再次悬浮于50 mL等渗盐水中，得到无色无味的粪菌液置于-80 ℃冰箱保存备用。另选3名健康个体年龄、性别等与卒中患者相匹配，排除既往及近期无卒中病史、胃肠疾病病史、精神心理病史、成瘾性药物或其他非成瘾性药物依赖史，近6周内无使用抗生素药物史，粪便取材。

1.2.2动物造模 分别将盐酸环丙沙星、法罗培南胶囊、甲硝唑片及青霉素V钾片研磨，根据体质量计算大鼠4种抗生素用量后混匀，对4组大鼠进行抗生素灌胃处理[12]，连续灌胃10 d，破坏大鼠原有肠道菌群，提升肠道菌群移植成功率。抗生素灌胃结束后，各组按计划移植肠道菌群。实验组每日灌肠500 μL、连续3 d，同时给予大鼠粪菌液500 μL灌胃、每3 d重复操作1次，直至第4周慢性应激造模结束时，以维持肠道菌群的稳定；且每天给予1种慢性应激刺激。在4周内相继给予大鼠孤养并中度不可预测应激处理：动物予以夹尾2 min、禁水禁食24 h、45 ℃环境5 min、昼夜颠倒24 h、倾斜鼠笼24 h、4 ℃冰水游泳5 min、潮湿垫料24 h共7种方法刺激，这7种刺激每天随机采取1种，共安排4周。对益生菌保护组在移植卒中患者肠道菌群及慢性应激刺激的同时予益生菌口服，对照组移植正常人肠道菌群及予慢性应激刺激，空白组仅移植正常人肠道菌群。

1.2.3取材 造模第4周末，从大鼠肛门处收集新鲜粪便约1 g，每次收集的粪便均置于-80 ℃冰箱保存备用；后将大鼠麻醉断头后取血，于4 ℃冰箱保存过夜，第2天以6 000 r/min离心 15 min，检测血清中Hcy，VB12及FA水平(按试剂盒说明书)。粪便标本解冻以后，按照粪便基因组DNA快速提取试剂盒的操作手册，提取细菌DNA。

1.2.4检测指标 在实验前1 d、第2周及第4周称取大鼠体质量后进行糖水偏好实验及旷场实验。第4周末时评价实验造模情况同时检测Hcy、VB12、FA水平及大鼠肠道细菌群落(双歧杆菌属、普雷沃菌属、大肠杆菌属、颤螺菌属、拟杆菌属、梭状杆菌属、罗斯式菌属、别样杆菌属)构成情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 体质量

实验前各组大鼠体质量测量结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第2周末及第4周末时，各组大鼠体质量增长值均低于空白组(P<0.05)；第4周末时实验组和益生菌保护组体质量增长值低于对照组(P<0.05)。见表1、图1。

注：(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与对照组比较，P<0.05。

表1 各组大鼠体质量变化情况

2.2 行为学观察

糖水偏好试验，第2周末及第4周末时，与空白组比较，实验组和益生菌保护组大鼠的消耗量降低(P<0.05)；第2周末时，实验组糖水消耗量低于对照组，快感缺失更明显(P<0.05)。在旷场试验中，第2周末时，实验组的总路程短于对照组、活动减少程度更明显(P<0.05)；与空白组比较，实验组、益生菌保护组及对照组大鼠的总路程明显缩短(P<0.05)；实验组和益生菌保护组大鼠的平均速度慢于空白组(P<0.05)；第4周末时，实验组及益生菌保护组大鼠的总路程均短于空白组(P<0.05)；实验组大鼠的总路程短于对照组(P<0.05)。见图2、图3、图4。

注：(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与对照组比较，P<0.05。

注：(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与对照组比较，P<0.05。

注：(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与对照组比较，P<0.05。

2.3 大鼠肠道菌群构成

大鼠粪便检测发现，实验组、对照组双歧杆菌属含量低于益生菌保护组(P<0.05)；实验组双歧杆菌属、普雷沃菌属、大肠杆菌属、颤螺菌属含量低于对照组，益生菌保护组颤螺菌属含量低于对照组(P<0.05)；实验组双歧杆菌属、普雷沃菌属、大肠杆菌属、颤螺菌属含量低于空白组，益生菌保护组普雷沃菌属、大肠杆菌属、颤螺菌属含量低于空白组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肠道菌群构成

2.4 血清VB12、FA、Hcy含量

第4周末，实验组大鼠血清VB12和FA含量低于对照组、Hcy含量高于对照组(P<0.05)，益生菌保护组大鼠血清VB12含量低于对照组、Hcy含量高于对照组(P<0.05)，空白组大鼠血清VB12及FA含量高于对照组(P<0.05)；实验组及益生菌保护组大鼠血清VB12及FA含量低于空白组、Hcy含量高于空白组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清VB12、FA、Hcy含量比较

3 讨论

肠道菌群移植技术是研究肠道菌群对疾病发生、发展影响的常用技术[13]。本研究采用和人肠道菌群类似的SPF级SD大鼠作为研究对象[14]，采取了移植卒中后患者肠道菌群至大鼠体内，模拟卒中后肠道菌群紊乱模型，以此为基础观察卒中后肠道菌群的改变是否会导致抑郁的发生、加重，并检测在移植后大鼠血清VB12、FA、Hcy水平，以了解血清VB12、FA、Hcy变化及抑郁程度之间的关系。结果显示，与对照组比较，实验组大鼠体质量下降、快感缺失、活动减少等抑郁症状更明显，证明了移植卒中后患者肠道菌群的大鼠抑郁易感性较移植健康人群肠道菌群的大鼠有所增加，与文献报道[15]一致。

本研究中，与移植健康人群肠道菌群的对照组相比，移植卒中患者肠道菌群的VB12、FA水平更低，Hcy水平更高，这种变化可能与肠道菌群结构改变相关，实验组大鼠双歧杆菌属、普雷沃氏菌属、大肠杆菌属、颤螺菌属丰度较对照组明显降低，双歧杆菌属、大肠杆菌属已被证实在体内可以合成大量VB12[16-17]，且双歧杆菌属也可合成FA[18]。缺乏FA及VB12将导致高同型半胱氨酸血症的发生(hyperhomocys- teinemia，HHcy)。Hcy的代谢通过蛋氨酸循环实现，该过程需要有FA与VB12的参与[19]，FA既是一种水溶性B族维生素，也是人类体内重要的微量元素[20]。若蛋氨酸循环途径发生障碍，则脑内神经中枢的甲基供体SAM生成则减少，使得单胺类神经递质如多巴胺(dopamine，DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(norepi-nephrine，NE)等的生成和代谢发生紊乱，而上述这些神经递质在PSD的发病中发挥着重要作用[21]。Hcy是目前导致神经精神系统疾病发生的一项重要因素[22]。Almeida等[23]发现当血浆Hcy浓度降低0.19 mg/L时，抑郁症的发生率将降低20%。国内研究者王海鹏等[24]发现，102例PSD患者中有68例伴有Hcy，占总病例数的2/3，PSD患者的抑郁程度与血浆Hcy浓度呈正相关。在本实验中，从行为学实验及体质量变化上来看，在第2周时实验组与益生菌保护组糖水偏好程度及活动量的减少都明显比对照组及空白组更严重，体质量的下降也更加明显，但到第4周时，4组大鼠旷场实验中平均速度无明显差异，这可能与除肠道菌群紊乱之外的导致行为学变化的其他因素开始作用有关。理论上，益生菌特别是双歧杆菌，被认为具有调节肠道功能、改善神经系统功能从而减轻焦虑、抑郁症状的作用[25]。而本研究中，益生菌保护组在体质量变化、旷场实验、糖水实验表现较实验组无明显改善，可能因为本研究中选用的双歧杆菌四联活菌片主要为改善腹泻及腹部不适，益生菌保护组结构改善不明显，与Hcy密切相关的细菌结构变化不大，并且实验对象不同，可能削弱了双歧杆菌的定植效果。且较高剂量的双歧杆菌属的摄入是否能影响叶酸的合成，也需进一步验证。肠道菌群中的普雷沃菌属及颤螺菌属也与动物行为学变化成正相关，但尚未有研究显示它们与VB12及FA的产生有关联，它们与Hcy之间的关系还需进一步探索。

综上所述，卒中后患者肠道菌群的紊乱会导致抑郁障碍的加重，这种现象可能与肠道菌群紊乱导致VB12及FA的合成下降，从而导致HHcy有关，为今后治疗和预防PSD提供了新的临床思路。