不同莓果提取物对小鼠慢性酒精性肝病的作用*

肖婷， 郭正红， 骆光佳， 张道芳， 陶玲， 沈祥春**

(1.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 药学院， 贵州省天然药物资源高效利用工程中心， 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳 550025; 3.贵州中医药大学 药学院， 贵州 贵阳 550025)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)又称为酒精性肝损伤，是由酗酒引起的肝脏疾病，其中超过40%ALD患者死于酒精性肝硬化[1]。虽然ALD发病率呈逐年递增的趋势，但发病机制比较复杂，其针对性治疗用药也并不明确。研究显示氧化应激和炎症反应是其发生发展的关键环节[2]，清除自由基和抗氧化是防治和治疗ALD的主要途径。乙醇在肝脏中主要通过乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶以及细胞色素P450进行代谢，在此过程中会产生过多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起体内的抗氧化系统紊乱，造成脂肝细胞损伤和死亡[3]。因此，含有抗氧化活性成分的植物资源成为开发临床治疗ALD潜在药物的关注重点。莓果类植物资源抗氧化活性最高，包括蓝莓、枸杞及桑葚等。枸杞总黄酮能明显降低丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)，有效改善肝脏的脂质过氧化，对肝脏具有较好的保护作用[4-5]。桑葚无糖提取物具有很强的抗氧化能力，我国历代的中医本草公认桑葚有补肝益肾、降压消渴和解酒的功效，可用于治疗肝肾阳虚[6-7]。当前，蓝莓、枸杞及桑葚这3种植物资源受到广泛关注，但是将其ALD保护作用进行对比研究却很少。本研究通过建立慢性小鼠ALD模型，观察蓝莓、枸杞及桑葚提取物对ALD小鼠肝脏的保护作用，并进行相互间效果差异对比。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 雄性昆明种小鼠110只，体质量18～20 g，购自贵州医科大学实验动物中心[合格证号 SCXK(辽)2015-0001]。

1.1.2莓果与主要试剂 蓝莓(黑龙江九三局山河农场蓝莓公司)，桑葚(贵州安龙大秦农业公园)，枸杞(宁夏杞天下生物科技有限公司)；无水乙醇(上海沃凯生物试剂有限公司)，甲醛(天津市永大化学试剂有限公司)。

1.1.3主要仪器 BS110S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，FD-1D-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，KH-300B型超声波清洗器(昆山禾创超声波仪器有限公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵和旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，TBA-40FR自动生化分析仪(日本东芝医疗系统株式会社)，XDS-2B倒置显微镜(日本尼康公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模及分组 参照文献[8]的造模及实验方法。110只小鼠随机均分为空白组、模型组、蓝莓提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高剂量)]组、枸杞提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高剂量)]组、桑葚提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高剂量)]组。适应性饲养 1 周后，用于慢性酒精性肝损伤实验。实验周期为 1 个月，此期间，空白组小鼠不做任何干预，自由给予水，与其他组喂养相同的饲料；模型组小鼠前15 d不做干预，后15 d每日定时灌胃30%乙醇(10 mL/kg) 进行造模；蓝莓、枸杞、桑葚提取物(低、中、高剂量)组小鼠每日定时灌胃相应剂量的莓果提取物 (5‰ CMC-Na 混悬)，实验前15 d每日定时灌胃不同剂量的莓果提取物，4 h 后灌胃给予30%乙醇进行慢性肝损伤模型制备。

1.2.2体质量和肝脏指数测定 实验结束时各组小鼠禁食 4 h，称量体质量，经腹腔注射60 mg/kg 戊巴比妥钠溶液进行麻醉，摘眼球取血；取各组小鼠肝脏组织，生理盐水洗净，吸干多余水分后进行称重并计算肝脏指数。

1.2.3血清生化指标检测 取“1.2.2”项下各组小鼠血清适量，静置1 h，1 500 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃低温保存，于自动生化分析仪中检测各组小鼠血清胆固醇(cholesterol，CHOL)、血清总胆红素(total bilirubin，TBIL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST) 含量。

1.2.4苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE ) 取“1.2.2”项下各组小鼠肝左叶组织于10%甲醛中保存48 h，用于肝脏组织病理学检查；38%盐酸1 mL和75%乙醇99 mL配置成1%盐酸乙醇分化液，28% 氨水0.2 mL和蒸馏水100 mL 配置成0.2%氨水，pH调至7.5；60 ℃ 下烤片2 h，二甲苯中脱蜡5～10 min，移入二甲苯和纯酒精(1 ∶1)混合液中5 min，依次加入100%、95%、85%、70%酒精浸泡，2～5 min/次；蒸馏水清洗，苏木精染液染色5～15 min，1%盐酸乙醇分化液分色；镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止；0.2%氨水中碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色；蒸馏水短洗 1 min，0.3%伊红染液染色5 min；蒸馏水短洗1 min，37 ℃烘干0.5 h，中性树胶封固；观察各组小鼠肝脏组织形态学改变情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般状态

实验前，各组小鼠状态均良好，体型适中，毛色有光泽，活动灵敏，胃口较好，睡眠良好，情绪较为稳定，无相互撕咬现象；实验结束时，空白组小鼠一般状态与实验前差异不大，而模型组小鼠状态差、毛色暗黄无光且蓬松、出现严重掉毛和相互撕咬现象、胃口较差、体型消瘦，桑葚提取物组小鼠状态一般、皮毛颜色偏黄略有蓬松、体型稍显瘦弱、动作灵敏、情绪尚且稳定，蓝莓提取物组和枸杞提取物组小鼠状态略差、皮毛松软、颜色微黄同时出现少量皮毛脱落现象、情绪较暴躁、出现相互撕咬现象、反应略迟钝。

2.2 体质量和肝脏指数

与空白组相比，模型组小鼠体质量明显减轻、肝脏指数明显升高 (P<0.001)；与模型组相比，桑葚提取物低、中、高剂量组小鼠体质量升高、肝脏指数下降 (P<0.05)，而枸杞和蓝莓提取物低、中、高剂量组间小鼠体质量及肝脏指数比较、差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体质量和肝脏指数

2.3 血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

与空白组相比，模型组小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL 含量明显升高 (P<0.001)；与模型组相比，枸杞和桑葚提取物低、中及高剂量组小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；与模型组相比，蓝莓提取物低、中及高剂量组小鼠血清AST、LDL、TBIL及CHOL含量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，3组提取物低、中及高剂量小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

2.4 HE染色

空白组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞形态大小规整，轮廓清晰，细胞间紧密接触，以中央静脉为中心大致呈放射状排列；模型组小鼠肝细胞出现广泛的空泡变性、气球样变，肝细胞水肿，胞浆成颗粒状；桑葚提取物低剂量组小鼠肝细胞广泛的水肿、并伴有炎症，中剂量组小鼠胞质形成空泡化、汇管区域周围的肝细胞胞质变性、并且细胞间嗜酸性颗粒密度增加，高剂量组较模型组的空泡变性显著减少、且肝细胞大小形态无明显异常、着色清晰、组织细胞排列均匀、较其他提取物剂量组更接近空白组肝细胞形态；枸杞提取物低剂量组小鼠肝细胞出现广泛的水肿及空泡变性、伴有细胞核破裂，中剂量组小鼠肝细胞部分组织边缘有坏死、且观察到部分肝细胞有明显的嗜酸性变，高剂量组小鼠肝细胞有轻度水肿、可见少许空泡变性、中央静脉周围肝细胞水样变性；蓝莓提取物低剂量组小鼠肝细胞存在广泛的水肿、空泡变性及气球样变，中剂量组小鼠肝细胞依然存在大量的空泡变性及嗜酸性变，高剂量组组小鼠肝细胞出现少量空泡变性和水样变性、肝细胞水肿；由此可见3种莓果提取物均可改善小鼠肝脏病变程度，但作用强弱有别，桑葚提取物表现出了最好的改善作用，其次为枸杞和蓝莓。见图1。

注：A为空白组，B为模型组，C～E分别为桑葚提取物低、中、高剂量组，F～H分别为枸杞提取物低、中、高剂量组，I～K分别为蓝莓提取物低、中、高剂量组。

3 讨论

ALD是由于长期大量饮酒，从而使得酒精与肝脏细胞频繁接触而导致肝脏损伤[2]。ALD可使肝脏细胞脂质过氧化，造成肝脏细胞坏死、凋亡、炎症、纤维化等病理变化，最终导致肝硬化甚至肝癌等疾病[9]。在我国，ALD占同期住院肝病患者构成比呈逐年上升趋势[10]。研究证明，长期过量饮酒导致小鼠食欲和吸收功能降低[11]，易造成小鼠营养不良、体质量下降[12]；肝损害会引起小鼠肝肿大、发育不良和肝硬化，肝脏指数在一定程度上可以反映肝脏的损伤[13]，当肝脏指数增加时，很可能是肝脏发生了肿大，发生增生、充血及水肿等病变[14]。本研究中模型组小鼠体质量较空白组下降、肝脏指数升高，说明造模成功；而采用莓果提取物进行预保护的给药组，体质量和肝指数均较模型组有所改善，在一定程度上对慢性ALD具有保护作用。

细胞酶是人体代谢过程中必不可少的催化剂[15]。ALD中存在脂代谢紊乱和转氨酶活性改变，由于酒精滥用会损害细胞膜的渗透性，导致储存在肝脏中的细胞酶会渗漏到血浆中[16]。血清ALT、AST、TBIL、CHOL及LDL是ALD的敏感观察指标，其中血清ALT和AST是肝脏功能重要的诊断指标[15，17-18]。ALT主要分布在肝细胞浆，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中，在正常情况下，2种酶只有极少量释放入血液中，故血清中2种酶的活性很低，但当肝组织受到急性损伤或细胞膜通透性增加时，ALT和AST大量释放到血液中，血清中酶的活性明显增高，因此血清ALT和AST升高幅度能反映肝细胞受损程度[19-21]。血清CHOL和LDL是诊断肝脏脂质代谢的重要指标，且游离CHOL是炎症的潜在诱因和肝纤维化的驱动因素[18]。脂质代谢异常作为ALD的一种并发症状，表现为酒精及代谢产物会导致血液中LDL含量增加，同时引起CHOL含量升高[18，21]。作为肝脏功能的重要诊断工具，血清TBIL水平与代谢综合征有密切的关系，如动脉粥样硬化和肝脏疾病[22]。TBIL主要由衰老的红细胞在肝、脾和骨髓等网状内皮系统内破坏降解而来，当肝细胞功能受到损伤或结构被破坏，或者胆汁排泄通路的障碍，其摄取、转化和排泄胆红素的能力降低，可导致胆汁摄取、转化、分泌及运输障碍，使肝脏清除胆红素的能力下降，使TBIL值增高[23]。因此以血清ALT、AST、LDL、CHOL及TBIL为指标，对小鼠肝损伤程度进行检测具有参考意义。本研究结果显示，3种莓果提取物均能够不同程度地降低小鼠各血清指标，保护慢性酒精性肝损伤。

酒精在肝脏中通过乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系统进行氧化代谢，主要中间代谢产物为乙醛，乙醛进一步在乙醛脱氢酶的作用下生成乙酸[24]。ALD主要是乙醇及其衍生物乙醛的代谢过程中直接或间接诱导的炎症反应、氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质及营养失衡等多种因素相互作用的结果，导致肉眼可见肝脏体积明显肿大、色黄、腻感及质地脆[24-25]；光镜下可见肝细胞体积肿胀、气球样变及点状坏死，变性的肝细胞内可见嗜酸性包涵体、周围常见中性粒细胞浸润[26-27]。本研究结果表明，模型组小鼠肝组织出现了空泡变性、水肿及肝细胞排列混乱等损伤，而3种莓果提取物对肝组织的水肿、变性等损伤有一定的改善作用，尤其是桑葚提取物高剂量组，其改善后肝组织和空白组相差不大。莓果提取物可通过抗氧化、促进凋亡等方式保护小鼠慢性ALD[8]。3种莓果提取物均可改善乙醇造成的小鼠肝脏损伤，但改善作用强弱有所差异，可能与它们含有的酚酸、黄酮以及花色苷等成分差异有关，具体的干预机制还有待进一步研究。

综上所述，通过对小鼠体质量、肝脏指数和血清ALT、AST、TBIL、CHOL、LDL水平及肝脏病理组织切片观察进行分析可知，蓝莓、枸杞及桑葚3种莓果提取物均对小鼠慢性ALD有一定的改善作用，但改善作用强弱有一定差异，桑葚提取物表现出了最强的活性，其次为枸杞和蓝莓提取物。本研究结果将有助于进一步阐述莓果类提取物对ALD的辅助保护作用，为莓果类食源性天然产物开发成为辅助保护肝损伤功能食品提供一定的实验基础。