DNA甲基转移酶基因多态性与SLT治疗脑卒中失语症疗效的关联性*

张静洁， 邹郝晶， 徐酩， 邢影

(1.西安交通大学 外国语学院， 陕西 西安 710049； 2.江苏省疾病预防控制中心， 江苏 南京 210009； 3.西安大兴医院 内分泌科， 陕西 西安 710082)

脑卒中是导致成人残疾甚至死亡的首要原因，而1/3脑卒中患者会出现失语症的临床症状，这是一种包括口语、写作、听觉理解和书面理解在内的语言交流障碍[1-3]，许多患者在被诊断为失语症后，因沟通障碍而感到孤独和痛苦[4]，使其社会参与度降低，严重影响生活质量，因此卒中后失语症的恢复显得极其重要。失语症患者除了自发恢复外[5]，言语—语言治疗(speech and language therapy,SLT)也可以促进患者语言沟通功能的恢复，其中治疗强度、剂量以及持续时间是主要决定因素[3]。脑卒中后语言能力的恢复过程较为复杂，包括神经可塑性、脑功能重建和肌肉活动等，DNA甲基化作为一种特殊的基因表达调控机制均参与了上述过程[6-8]。有研究显示，脑卒中后的血管生成与DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的活性呈正相关，Lin等[9]发现血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)基因的表达与血管生成呈负相关；而脑血管内皮细胞氧和葡萄糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)可以促进TSP-1基因启动子甲基化来抑制TSP-1的表达，提示DNMTs的过表达和活性增强可以促进卒中后血管的生成[10]；Baccarelli等[11]也发现血液DNA甲基化与发生脑卒中的风险和低死亡率显著相关；由此认为，DNMTs可能是卒中患者功能恢复的有利因素。在脑卒中的早期研究中，小鼠大脑中动脉栓(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型显示卒中动物脑内的DNA甲基化呈整体上调状态，且抑制DNMTs活性可以降低卒中的严重程度[12]；也有研究显示，在脑卒中后整体恢复或运动技能学习的过程中，DNMTs多态性可减慢或减少卒中后失语症患者的恢复[13]。本研究对DNMTs多态性在卒中后失语症患者恢复过程中的潜在遗传作用进行初步研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2015年1月—2018年10月就诊的脑卒中失语症患者42例，其中男27例、女15例，平均(62.7±9.4)岁，69.0%患者有伴侣；在教育方面，所有患者均具有基本阅读和理解能力，且59.5%研究对象接受过9年义务教育；在临床类型方面，缺血性脑卒中30例(71.4%)，出血性脑卒中12例(28.6%)；脑卒中后的平均时间为(27.2±8.8)d，恢复治疗的平均时间为(58.5±9.4)d。纳入标准：(1)均被诊断为脑卒中后失语症，并采用SLT法对其进行康复治疗；(2)发病持续时间<3个月，且没有自然痊愈的中国汉族人群；(3)所有受试者均被告知本次研究的整个项目，并签署知情同意书；(4)研究获医学伦理委员会批准。排除标准：(1)无基本阅读和理解能力；(2)酗酒、滥用药物、疑似或病前痴呆和病前精神病的患者；(3)既往脑卒中引起的失语症患者；(4)无法进行沟通患者；(5)卒中后抑郁症患者。最终，共有42名脑卒中患者被纳入本次研究。

1.2 方法

1.2.1STL治疗前后处理 本研究采用前瞻性随访研究设计。所有研究对象在STL治疗前均接受语言功能测试作为基线资料，以确保其为非自发性恢复；在STL治疗后再次进行测试，以评估STL的治疗效果；语言和交流方面存在问题的患者将按照标准SLT治疗方案分配言语治疗；失语症由两名来自不同医院的物理康复治疗专家独立诊断。SLT是一套标准化的汉语标准失语症检查法，至少包括72项分级的筛查和失语症严重程度量表(aphasia severity rating scale, ASRS)的专家评分。

1.2.2干预措施 住院脑卒中患者平均每周接受SLT治疗4 h 。在SLT治疗之前，评估每个患者的个人需求和语言能力，以制定个性化的治疗方案。第1个月是认知语言治疗，采取以认知障碍为导向的治疗来优化处理受影响的语言层面(语义、语音、语法)；在语言功能初步好转后，第2个月以恢复人际沟通能力为重点治疗策略。以治疗8周为1个研究周期，8周后对所有受试对象进行STL效果评估。

1.2.3结局评定和数据提取 采用Amsterdam-Nijmegen日常语言测试(ANELT)和Boston命名测试(BNT)对失语症进行评分，并评估失语症的恢复情况[14-15]，该方法是目前失语症研究的较常见方法，具有客观与可量化性。ANELT得分范围为10～50分，BNT得分范围为0～60分[16]，本研究以治疗后ANELT得分-治疗前ANELT得分=10分，或治疗后BNT得分-治疗前BNT得分=10分为SLT治疗有效。按以上标准，本研究将接受治疗后的42名脑卒中失语症患者分为治疗有效组(18例)及治疗无效组(24例)。

1.2.4样品制备和基因分型 采用QIAcube HT试剂盒(Qiagen，德国)按照说明书提取所有患者外周静脉血中的全基因组DNA，用NanodropOneC超纳米紫外分光光度计(ThermoFisher Scientific，美国) 测定A260/A280的比值来估计DNA的纯度,下限和上限分别为1.8和2.0，纯化后的DNA置-80 ℃保存待用。采用ABI7900HT实时PCR系统(Applied Biosystems, 美国)对DNMTs特定单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型，将特定的对照样本(至少已知3个基因分型)加入每个样品板进行质量控制。每位患者的SNP基因分型由两位经验丰富的实验人员进行评估，随机选择超过10%的样本进行验证。

1.3 统计学分析

采用χ2拟合优度检验评估各个SNP基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(HWE)，采用Studentt检验对人口学和临床特征等连续性变量在脑卒中失语症治疗有效患者组和治疗无效患者组之间的分布差异进行比较。在调整年龄、性别、婚姻状况、受教育程度等因素后，采用条件Logistic回归分析计算各个SNP基因型的比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)。采用SHEsis软件对基因位点的多态性进行单体型分析。

2 结果

2.1 临床特征

经过STL治疗后，脑卒中失语症治疗有效和治疗无效组患者的性别、年龄、配偶情况以及卒中类型比较，差异无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组脑卒中失语症患者一般特征及临床特征

2.2 DNMTs多态性与脑卒中失语症的关联分析

检测42例脑卒中失语症患者DNMTs基因(DNMT1、DNMT3A及DNMT3B)的基因型及等位基因分布，见表2。在8个DNMTs多态性中，仅有DNMT1rs222861的分布在脑卒中失语症治疗有效患者组和治疗无效患者组的差异有统计学意义(P<0.05)；该SNP的C等位基因与脑卒中失语症的治疗无效风险呈正相关(OR=4.46，95%CI为1.27～15.60，P=0.019)；与携带TT基因型的患者相比，CC基因型和TC+CC基因型携带者脑卒中失语症治疗无效的风险增加(CC：OR=18.17，95%CI为1.38～238.91，P=0.027；TC+CC：OR=7.57，95%CI为1.25～45.92，P=0.019)。由于本研究样本量较少，SNPrs2228612在分层分析中仅表现出对男性患者的治疗无效性的重要影响(OR=35.17, 95%CI=1.68～735.28,P=0.022)，见表3。在此基础上，对脑卒中失语症患者的DNMTs多态性进行单体型分析，以评估同一基因中SNPs的联合效应，结果显示DNMT1的单倍型在脑卒中失语症治疗有效患者组和治疗无效患者组中分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表2 8种DNMTs基因多态性在两组脑卒中失语症治疗有效组与治疗无效组患者中的分布[n(%)]

续表

表3 两组脑卒中失语症患者rs2228612 基因多态性分层分析[n(%)]

表4 两组脑卒中失语症患者DNMT1 基因SNP位点的单倍型分析[n(%)]

3 讨论

研究表明，一些神经营养因子和脑功能相关基因是卒中后失语症恢复治疗的潜在靶点或影响因素，其中，BDNF、GRIN2A和CNKSR2等“关键基因”与失语症恢复治疗有着很强的相关性[16-21]。尽管在不同疾病中的作用和影响还存在一定的争议，但在某些特定疾病中，这些基因的甲基化和特殊的多态性可以增加疾病发生的风险，也是疾病恢复过程中的重要阻碍因素。

本研究通过分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B多态性对卒中后失语症患者语言恢复的影响，结果发现DNMT1多态性rs2228612与卒中后失语症患者恢复的不良结局显著相关，表明rs2228612是卒中后失语症恢复的危险因素，降低了失语症治疗的成功率。有研究发现，特定BDNF多态性中Met等位基因对中国、美国缺血性脑卒中患者的结局影响不同[16,22]。但本研究在千人基因组计划基础上进一步分析发现，并没有实质性的证据表明只有Met等位基因在这两组人群之间存在差异。而且不同种族之间的DNA甲基化模式存在较大差异已被广泛证实。因此，甲基化在不同人群之间的差异似乎比特定的多态性更可信，尤其是在卒中后失语症中。

本研究存在一些局限性。当前研究的样本量较小，虽然已经满足最小样本含量，但失语症恢复评估测试的最终分值差异较大，减少了发现DNMTs基因存在显著差异的机会，甚至可能会影响住院患者康复的进度。另一方面，甲基化修饰形式太多，如CpG岛甲基化、DNA相关转录因子甲基化以及mRNA甲基化(m6A或m5)等。这些甲基化修饰是疾病发生、发展和康复的过程中普遍存在的甲基化调控机制，相当复杂。此外，在临床实践中，失用症通常会伴随失语症，在失语症住院患者中很难通过语言表现障碍来鉴别失用症。在接下来的临床调查和基础研究中，将重点研究高甲基化的机制并补充相应信息。

综上所述，DNMT1rs2228612的不同遗传模式可以影响中国人群脑卒中后失语症的康复效果。如果可以在大样本人群中得到证实，则该SNP可能是SLT治疗卒中后失语症的重要补充指标。