两种儿童肺炎早期部分免疫指标的变化及临床价值*

卓佳佳， 苏晓霁， 张晨宇， 张诗海, 朱丽娟

(安徽省儿童医院 检验科， 安徽 合肥 230001)

肺炎支原体是引起儿童呼吸道感染的病原体之一，除会引起上呼吸道感染外，还能引起间质性肺炎，可占到非细菌性肺炎的1/3以上，其临床表现和影像学所见都类似病毒性肺炎[1-2]；巨细胞病毒(HCMV)又称为人疱疹病毒5型，其感染极为广泛，也是儿童感染常见的病原体之一，临床多见于肝炎和肺炎[3-4]。两种病原体的感染都可以引起患者的免疫状态失衡，造成病情的迁延或处于感染状态[5-6]。肺炎支原体和HCMV引起的肺炎为住院儿童最常见的肺炎类型，许多文献都探讨了两种病原体感染后患者免疫状态的改变[7-12]，但较少关注感染早期的变化特点，查阅文献未见两种病原体感染肺炎患者免疫状态比较的研究。为了解患儿感染两种病原体后早期免疫功能的变化、及这种变化能否辅助两种肺炎的鉴别诊断，本研究选取2019年1月—2020年12月住院的肺炎患儿160例(肺炎支原体肺炎129例、巨细胞病毒肺炎31例)，检测其外周血中各类淋巴细胞以及血清免疫球蛋白，探讨两种病原体肺炎感染与机体免疫状态的改变的关系。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1一般资料 选取2019年1月—2020年12月收治的129例肺炎支原体肺炎患儿作为支原体组，男78例、女51例，年龄(3.01±2.79)岁；其中31例HCMV肺炎患儿作为病毒组，男20例、女11例，年龄(3.05±2.98)岁，2组患儿共160例作为研究组；肺炎相关诊断标准参照文献[13-14]。纳入标准：(1)临床表现有发热、咳嗽、头痛和咽喉痛等症状，病程<7 d；(2)影像学显示肺部炎症改变；(3)实验室在收集到的肺泡灌洗液中检出肺炎支原体或HCMV核酸；(4)通过肺泡灌洗液细菌涂片及培养和血清呼吸道病原体抗体9联检等相关指标，排除存在混合感染的可能。排除标准：(1)患血液系统疾病、免疫系统疾病或全身感染等严重疾病;(2)近期使用抗生素或者激素;(3)存在免疫功能缺陷;(4)有家族性遗传病。正常对照儿童50例作为对照组，为眼科住院病人，住院前期各项检查已排除肺炎感染，其中男34例、女16例，年龄(3.54±3.31)岁。本研究获医院伦理委员会批准 (批准文号2019-SR-196)，所有纳入研究患者知情同意。

1.1.2仪器与试剂 BD公司FACSCanto Ⅱ流式细胞仪、ABI公司QuantStudio DX实时荧光定量PCR仪、日立7600型全自动生化分析仪，Beckman公司荧光标记复合检测试剂、湖南圣湘公司肺炎支原体核酸定量检测试剂盒和HCMV核酸定量检测试剂盒。

1.2 研究方法

1.2.1标本收集 研究组(支原体组和病毒组)和对照组儿童入院时采集外周血标本、研究组患儿同时采集肺泡灌洗液标本，外周静脉血采用EDTA-K2抗凝管和生化专用管保存，肺泡灌洗液标本利用纤维支气管镜收集并注入无菌专用管。

1.2.2淋巴细胞亚群比例的检测 取流式上样离心管，加入混匀的100 μL抗凝全血和10 μL标记荧光基团的复合检测试剂，混匀后37 ℃避光孵育20 min，加入500 μL溶血素，混匀后37 ℃避光孵育20 min、上机检测。通过流式细胞仪检测各种细胞表面的荧光信号，获得表达CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD56+、CD3-CD19+的各群细胞的比例。

1.2.3血清IgM、IgA、IgG浓度检测 使用全自动生化仪采用散射比浊法检测血清IgM、IgA、IgG浓度，通过反应体系的浊度，最终获得准确的定量结果。

1.2.4肺炎支原体和HCMV核酸检测 取混匀的支气管肺泡灌洗液1 mL加入1.5 mL规格的Epp管，1 000 r/min离心5 min后弃去上清，加入100 μL核酸释放液后混匀，室温放置30 min后1 000 r/min离心5 min，将10 μL上清液加入至配制好的反应体系中，放入PCR仪自动运行预先设置的反应条件；反应结束后，根据计算获得的标准曲线得到病原体核酸的拷贝数。对不同病原体的病例，按照检出病原体拷贝数从低到高进行顺序排列，患儿分别根据肺炎支原体和HCMV拷贝数跨度的指数范围平均分割，分为低、中、高拷贝3个病例组，选取低拷贝病例组和高拷贝病例组进行统计分析。肺炎支原体高拷贝组核酸为107～109拷贝/mL、低拷贝组核酸为102～104拷贝/mL；HCMV高拷贝组核算为106～107拷贝/mL、低拷贝组核酸为102～103拷贝/mL。

1.3 观察指标

比较支原体组、病毒组和对照组儿童外周血中各类淋巴细胞的百分比和血清中IgM、IgA和IgG的浓度，比较肺炎支原体高拷贝组和低拷贝组、HCMV高拷贝组和低拷贝组外周血中各类淋巴细胞的百分比和血清中IgM、IgA和IgG的浓度，分析这些免疫指标的变化及临床价值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 不同肺炎患儿外周血淋巴细胞亚群比例和免疫球蛋白浓度

2.1.1支原体组与对照组 支原体组CD3+CD4+淋巴细胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3-CD19+淋巴细胞比例高于对照组(t=5.06、4.83、12.41，P<0.05)，CD3-CD16+CD56+淋巴细胞比例低于对照组(t=-13.17，P<0.05)；两组间CD3+淋巴细胞比例、CD3+CD8+淋巴细胞比例比较，差异无统计学意义(t=0.53、-0.55，P>0.05)。见表1。支原体组的IgG和IgA浓度低于对照组(t=-7.79、-7.57，P<0.05)，IgM浓度高于对照组(t=3.54，P<0.05)。见表2。

2.1.2病毒组与对照组 病毒组CD3+CD8+淋巴细胞比例和CD3-CD19+淋巴细胞比例高于对照组(t=2.42、3.32，P<0.05)，CD3-CD16+CD56+淋巴细胞比例低于对照组(t=-9.30，P<0.05)；2组CD3+淋巴细胞比例、CD3+CD4+淋巴细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值比较，差异均无统计学意义(t=0.69、1.32、1.13，P>0.05)，见表1。病毒组的IgG浓度和IgA浓度低于对照组(t=-2.63、-12.10，P<0.05)；两组间IgM浓度比较差异无统计学意义(t=-0.63，P>0.05)，见表2。

2.1.3支原体组与病毒组 支原体组CD3+CD8+淋巴细胞比例低于病毒组(t=-2.33，P=0.02<0.05)，两组间CD3+淋巴细胞比例、CD3+CD4+淋巴细胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3-CD16+CD56+淋巴细胞比例及CD3-CD19+淋巴细胞比例比较，差异均无统计学意义(t=-0.47、1.28、1.97、-0.26、1.65，P=0.64、0.20、0.05、0.79、0.10)，见表1；支原体组的IgA浓度和IgM浓度高于病毒组(t=6.37、2.42，P<0.001、P=0.02)，2组IgG浓度比较，差异无统计学意义(t=-0.06，P=0.95>0.05)，见表2。

表1 支原体组和病毒组及对照组的淋巴细胞亚群比例和比值

表2 支原体组和病毒组及对照组的血清免疫球蛋白浓度

2.2 高拷贝组和低拷贝组外周血淋巴细胞亚群比例和免疫球蛋白浓度

2.2.1肺炎支原体 肺炎支原体高拷贝组的CD3-CD16+CD56+淋巴细胞比例高于低拷贝组(t=-2.19，P=0.03)；其余CD3+淋巴细胞比例、CD3+CD4+淋巴细胞比例、CD3+CD8+淋巴细胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、及CD3-CD19+淋巴细胞比例在两组间比较，差异无统计学意义(t=-0.01、1.28、-1.03、1.48、0.96，P>0.05)，见表3。肺炎支原体高拷贝组免疫球蛋白IgA浓度和IgM浓度高于低拷贝组(t=-2.32、-2.97，P<0.05)，两组IgG浓度比较，差异无统计学意义(t=-1.21，P>0.05)，见表4。

2.2.2HCMV病毒 HCMV病毒高拷贝组的CD3+CD8+淋巴细胞比例高于低拷贝组(t=-2.52，P<0.05)，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值低于低拷贝组(t=2.44，P<0.05)；两组CD3+淋巴细胞比例、CD3+CD4+淋巴细胞比例、CD3-CD16+CD56+淋巴细胞比例和CD3-CD19+淋巴细胞比例比较，差异均无统计学意义(t=-0.01、1.79、0.41、0.50，P>0.05)，见表3；两组免疫球蛋白IgG浓度、IgA浓度和IgM浓度比较，差异无统计学意义(t=0.72、1.36、-0.36，P>0.05)。见表4。

表3 两种肺炎不同拷贝组的淋巴细胞亚群比例和比值

表4 两种肺炎不同拷贝组的血清免疫球蛋白浓度

3 讨论

成熟淋巴细胞是机体内重要的免疫细胞之一，可以分为：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞三大群。T淋巴细胞是一群非常重要的淋巴细胞,是参与机体细胞免疫反应并主导调节的一群细胞，其中细胞表面表达簇分化抗原(CD分子)CD3+淋巴细胞是成熟T淋巴细胞，检测其比例直接反映T淋巴细胞的成熟活化程度。成熟T淋巴细胞又可分为CD4+和CD8+两个亚群：CD4+淋巴细胞被称为辅助性淋巴细胞，可以诱导和增强其他免疫细胞的免疫应答；CD8+淋巴细胞被称为细胞毒性淋巴细胞，可以调节和抑制对外界抗原的免疫反应，消灭受感染的细胞。两群细胞之间相互调节和限制达到免疫平衡，既可以清除有害物质保护机体又可以避免过度免疫损伤机体。所以二者的比例也是反应机体免疫功能变化的重要指标。NK细胞(CD3-CD16+CD56+)，又叫自然杀伤细胞，是一种非特异的杀伤细胞，可以杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞和寄生虫等，是重要的细胞免疫细胞。B淋巴细胞(CD3-CD19+)是一种体液免疫相关的细胞，在接受抗原刺激后可增殖分化为浆细胞，浆细胞可分泌和合成大量包括IgG、IgA、IgM在内的各类免疫球蛋白，临床实验室利用流式细胞术和自动生化检测仪，检测和计算它们的数量、比例和浓度，通过分析得到的数据，可以推测出机体细胞免疫和体液免疫状态的变化。

患者感染肺炎支原体和人HCMV后，临床症状主要有咳嗽、发热、头痛、咽喉痛等，感染5～10 d后症状逐渐消失，因此选择病程为<7 d的呼吸科肺炎患者作为早期肺炎的研究对象。共收集研究对象160例，其中诊断为重症肺炎7例，由于例数较少，且各指标水平与非重症病例相比没有观察到明显差异，所以未进行单独分组比较研究。本文中关于HCMV肺炎的研究结果与同类研究结果相近[15-18]，而关于肺炎支原体肺炎的结果与同类文章的结果略有出入[19-22]。由于本研究选择的都为感染早期病例，患者机体处于免疫系统系统激发早期，因此感染中后期的淋巴细胞亚群水平和免疫球蛋白水平变化没有涉及，可以推测的是：在肺炎支原体感染的中后期或临床治疗的介入后，患者各项指标可能发生了不同趋势的改变，导致了数据分析结果的不确定，具体结论有待于在将来的进一步研究中探讨。

在肺炎支原体肺炎的早期，机体的细胞免疫和体液免疫发生明显活化，CD3+CD4+淋巴细胞比例明显增加，CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值升高，表明在感染的早期即快速激活了免疫系统应答，促进和调节其他免疫细胞的反应；CD3-CD19+淋巴细胞比例增高，表明体液免疫相关细胞增多，被激活后可产出大量免疫球蛋白；免疫球蛋白中IgM浓度明显上升，反映了B细胞在比例升高的基础上，活化产出大量IgM。在HCMV肺炎的早期，机体则显示不同的免疫状况：CD3+CD4+淋巴细胞比例改变不明显，CD3+CD8+淋巴细胞比例明显升高，表明病毒感染早期即激活了细胞免疫相关细胞，启动针对细胞的杀伤反应； CD3-CD19+淋巴细胞比例增高，表明体液免疫相关细胞增多，被激活后可产出大量免疫球蛋白；三种免疫球蛋白IgM、IgA和IgG的浓度明显下降，反映了在HCMV感染早期，B细胞产生免疫球蛋白的能力被明显抑制。对于两种病原体肺炎的淋巴细胞亚群分析可以看出：肺炎支原体感染早期表现为CD3+CD4+淋巴细胞比例升高的比较明显，而HCMV则表现为CD3+CD8+淋巴细胞比例更加明显，虽然比较二者CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值没有明显差异(P=0.05)，但已呈现出一高一低的变化趋势。比较两者免疫球蛋白浓度变化，可以发现肺炎支原体肺炎病人的总体免疫球蛋白浓度要略高于HCMV感染的病人，主要体现在IgM和IgA的浓度明显较高。以上说明了无论是肺炎支原体肺炎还是HCMV肺炎早期，机体的的细胞免疫和体液免疫都是明显活化的，但前者表现更为明显。以上的结果与另一种呼吸道常见病原体肺炎链球菌相比，对人体免疫指标的影响有着不同的特点[23-24]。在不同病原体拷贝数的患者免疫指标的比较中，肺炎支原体高拷贝组患者的免疫球蛋白IgA和IgM的浓度高于低拷贝组患者，说明了两种免疫球蛋白浓度变化对于病原体浓度改变更加敏感；而HCMV高拷贝组患者CD3+CD8+淋巴细胞比例明显高于低拷贝组患者，CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴细胞比值也相应的较低，说明了CD3+CD8+淋巴细胞比例和CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴细胞比值的对病原体浓度高低变化更敏感。不同病原体的感染对患者免疫系统平衡状态的改变各不相同，对于肺炎支原体肺炎患者，可以监测血液中的免疫球蛋白IgA和IgM的浓度的变化，对于HCMV肺炎患者，则可以选择监测CD3+CD8+淋巴细胞比例和CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴细胞比值两项指标。

综上所述，利用流式细胞技术和自动生化指标检测系统，检测两种肺炎患者血中淋巴细胞亚群和血清免疫球蛋白浓度并且进行的分析，明确病原体引起患者免疫系统失衡状态的程度，对辅助病原体感染后临床评估以及制定相应个体化免疫治疗方案具有重要参考价值。