毛冬青三萜皂苷对动脉粥样硬化大鼠肠道菌群的影响

白荣钰，易 欢，陈丰连，邱静文，王 莹，陈冰莹，李 瑜，张 蕾*

1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

2.广州中医药大学护理学院，广东 广州 510006

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎性疾病，是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病发生发展的病理基础，其发病机制复杂，涉及内皮细胞损伤、脂质沉积、炎性细胞的聚集浸润、炎性因子的释放、血小板的聚集活化、血管平滑肌增殖与迁移等多种病理过程[1]。AS与人体衰老过程密切相关，其相关疾病的死亡率位居我国首位。研究表明，肠道微生物结构和功能的异常可通过三甲胺/三甲胺N-氧化物、初级和次级胆汁酸、短链脂肪酸、细菌内毒素易位等多种途径促进AS、高血压、心衰、心肌缺血等心血管疾病的发生和发展[2]。Eelke等[3]将Casp1-/-小鼠的促炎性肠道菌群移植至Ldlr-/-小鼠，发现促炎性肠道菌群会增强小鼠全身性炎性反应并加速AS的形成。在中医“心与小肠相表里”的理论指导下，越来越多的研究表明在中医药治疗心血管疾病的作用机制中，中药与肠道微生态相互作用的过程是关键的环节[4]。

毛冬青是冬青科冬青属植物毛冬青Ilex pubescensHook.et Am.的干燥根，主产于广东、广西、湖南等地，具有消肿止痛、活血通脉、清热解毒等功效[5-6]，已被开发成针剂、片剂、胶囊剂等，临床上广泛用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑血栓、血栓性脉管炎、中心视网膜炎等疾病[5]。毛冬青主要活性成分为三萜皂苷类成分[7-8]。毛冬青三萜皂苷（IPTS）的口服生物利用度低，本课题组前期研究表明，IPTS主要分布于胃肠道和胸主动脉，仅有少量分布于心脏、肝脏和肾脏，脑中几乎检测不到[9]。其较低的生物利用率难以直接解释其对AS等心血管疾病的治疗作用，本研究拟探究IPTS对AS大鼠肠道菌群的调节作用及其机制，为IPTS治疗AS提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量（180±20）g，6～7周龄，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（粤）2013-0034。动物于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房适应性喂养1周，温度（24±2）℃、12 h光昼交替，自由进食饮水。动物实验经广州中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（批准号ZYD-2020-065）。

1.2 药材

毛冬青购自广州致信药业股份有限公司，经广州中医药大学张丹雁教授鉴定为冬青科冬青属植物毛冬青I.pubescensHook.et Am.的干燥根。

1.3 药品与试剂

毛冬青皂苷B1对照品（质量分数＞98%）购自维克奇生物科技有限公司；高脂饲料（由3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、10%猪油、5%白糖、81.3%基础饲料组成）购自北京华阜康生物科技股份有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、甲醛溶液和水合氯醛购自广州苏铖粤贸易有限公司；辛伐他汀片（20 mg/片，批号T020243）购自上海信谊万象药业股份有限公司；维生素D3注射液（批号20190401）购自哈尔滨市道外区宏达动物药品厂；总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒（批号20190924）、三酰甘油（triglycerides，TG）试剂盒（批号201909016）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒（批号20190905）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒（批号20190905）和一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒（批号20190904）购自南京建成生物工程研究所；内皮素-1（endothelin-1，ET-1）ELISA试剂盒（批号I30013321）和血管紧张素-II（angiotensin-II，Ang-II）ELISA试剂盒（批号J22013320）购自武汉华美生物工程有限公司；琼脂糖购自广州浩玛生物科技有限公司；3422A 100bp DNA ladder购自日本Takara公司；引物由美国Thermo Fisher Scientific公司合成；无水乙醇均为分析纯，购自广州苏城粤有限公司；凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司；粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 仪器

多功能酶标仪（美国Promega公司）；生化培养箱（上海和呈仪器制造有限公司）；冷冻切片机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司）；制冰机（郑州南北仪器设备有限公司）；实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；5417R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混合器电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 IPTS的制备

将毛冬青饮片打成粗粉，加入10倍量水浸泡24 h，定时搅拌，浸泡2次，滤过，弃去滤液。粗粉再按料液比1∶10加入85%～90%乙醇，加热回流提取2次，1 h/次，收集滤液，浓缩，干燥后得提取物粉末。粉末分散于5倍量10%～20%乙醇中，滤过，弃去滤液，沉淀经干燥后得IPTS。以毛冬青皂苷B1为对照品，采用比色法[10]测定总三萜皂苷的含量，标准曲线为Y＝369.95X－0.052 9（R2＝1），计算得三萜皂苷的质量分数为81.63%。

2.2 造模、分组与给药

SD大鼠随机分为对照组、模型组、辛伐他汀（5 mg/kg）组和IPTS低、中、高剂量（30、60、120 mg/kg，分别相当于临床剂量的0.5、1.0、2.0倍）组，每组10只。模型组、辛伐他汀组和IPTS低、中、高剂量组大鼠给予高脂饲料喂养8周，并于第3天ip维生素D3注射液（7×105U/kg）；对照组大鼠给予正常饲料喂养，并于第3天ip等体积0.9%氯化钠溶液。IPTS溶于0.5% CMC-Na分别配制成质量浓度为30、60、120 mg/mL的溶液，超声20 min使其分散均匀；辛伐他汀片溶于0.5% CMC-Na配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液。各给药组大鼠自造模第1天ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组大鼠ig等体积0.5% CMC-Na溶液，1次/d，连续8周。

2.3 粪便样本采集

给药结束后，将大鼠置于代谢笼中，连续收集8 h的粪便样本，分装于2 mL冷冻离心管中，于-80 ℃保存。

2.4 IPTS对AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量的影响

收集粪便后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉取血。血液静置30 min，4 ℃、3800 r/min离心10 min，分离得到血清。按照试剂盒说明书测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量。

2.5 IPTS对AS大鼠胸主动脉病理变化的影响

大鼠失血致死，解剖取胸主动脉，除去胸主动脉的脂肪组织，于冰浴上用0.9%氯化钠溶液冲洗组织，切取部分胸主动脉组织置于4%甲醛溶液中，用常规石蜡包埋，均匀切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察并拍照。

2.6 粪便中细菌DNA的提取与测序

2.6.1 DNA的提取与检测 按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书提取总DNA，采用微量分光光度计测定样品DNA的浓度和纯度，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA完整性。

2.6.2 PCR扩增及产物检测 选用上游引物515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’）对大鼠粪便样本的16S rRNA V4区进行扩增。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段长度和浓度，主带长度在290～310 bp的样品可用于进一步的实验；利用GeneTools软件（Version 4.03.05.0）对PCR产物进行浓度对比，再计算每个样品所需的体积，将每个PCR产物进行混合。使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，用TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。

2.6.3 16S rRNA 基因测序 使用 Illumina Hiseq2500平台对样本进行16S扩增子测序，采用paired-end双端测序方式对产物的V4区域进行高通量测序，测序过程在广东美格基因科技有限公司进行。

2.6.4 测序数据分析 利用USEARCH软件对样本的Clean Tags 进行分类学单元操作（operational taxonomic unit，OTU）聚类，借助QIIME平台对OTU数据进行β多样性分析、Lefse分析和PICRUSt功能预测。β多样性分析主要是针对组间差异性进行分析，可以判断相同条件下样本组成的相似程度，样本之间的距离表示样本的组成相似程度，样本点越接近说明样品的相似程度越高。LEfse分析可以对多个组别之间进行比较，从而找到各组在丰度上有显著差异的物种。通过PICRUSt功能预测来推测样本中的菌群基因功能的构成，从而分析不同组别之间在功能上的差异。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据统计分析，计量资料满足正态分布以±s表示，计量资料不满足正态分布用M（P25，P75）描述；多组资料进行单因素方差分析检验，如方差齐采用LSD检验，如方差不齐采用DunnettT3检验；不符合正态分布的计量资料比较采用非参数Mann-Whitney U检验。

3 结果

3.1 IPTS对AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、ET-1和Ang-II含量的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显升高（P＜0.01），HDL-C水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组和IPTS高剂量组大鼠血清中TC水平显著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C水平明显升高（P＜0.05）；辛伐他汀组大鼠血清中LDL-C水平显著降低（P＜0.05）。

表1 IPTS对AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影响 (n = 10)Table 1 Effect of IPTS on contents of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of AS rats (n = 10)

如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中NO水平显著降低（P＜0.01），ET-1和Ang-II水平显著增高（P＜0.05、0.01），NO/ET-1显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，IPTS各剂量组大鼠血清中NO水平显著升高（P＜0.05、0.01），ET-1和Ang-II水平显著降低（P＜0.05、0.01）；IPTS各剂量组和辛伐他汀组大鼠血清中NO/ET-1显著升高（P＜0.05、0.01)。

表2 IPTS对AS大鼠血清中NO、ET-1和Ang-II含量的影响 (n = 10)Table 2 Effect of IPTS on contents of NO, ET-1 and Ang-Ⅱ in serum of AS rats (n = 10)

3.2 IPTS对AS大鼠胸主动脉病理变化的影响

如图1所示，对照组大鼠胸主动脉壁未见增厚，未见粥样硬化斑块形成，血管内皮光滑，未见损伤脱落；模型组大鼠胸主动脉管壁中有明显的蓝色钙化斑块形成，可见胆固醇结晶，血管内皮损伤脱落，有坏死的组织沉积；辛伐他汀组大鼠胸主动脉管壁有些增厚，无明显斑块，血管内皮粗糙，有些损伤脱落；IPTS中、高剂量组大鼠大部分动脉壁未见增厚，血管内皮大致正常，较平滑，未见明显损伤脱落；IPTS低剂量组大鼠胸主动脉壁有些增厚，但无明显斑块，血管内皮较粗糙。

图1 IPTS对AS大鼠胸主动脉病理变化的影响 (HE, ×100)Fig.1 Effect of IPTS on pathological changes of thoracic aorta in AS rats (HE, × 100)

3.3 大鼠肠道菌群多样性分析

β多样性分析中样品的空间距离越接近，样品的物种组成结构越相似。如图2所示，模型组与对照组肠道菌群组成有很大差异；IPTS中、高剂量组肠道菌群组成彼此间接近，与模型组有较大差异，表明IPTS可以调节大鼠肠道菌群的组成。

图2 各组粪便样本β多样性PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of β diversity in feces samples of each group

3.4 肠道菌群物种归属与差异分析

将OTU表格中的信息按照门水平提取序列信息，并计算各物种的相对丰度，同时选取相对丰度在1%以上的物种绘制物种相对丰度分布图（图3）。从门水平上看，4组之间的优势菌群主要为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门。与对照组相比，模型组大鼠肠道菌群中拟杆菌门相对丰度降低，变形菌门相对丰度增加，厚壁菌门相对丰度差异不大；与模型组相比，IPTS中、高剂量组大鼠肠道菌群中拟杆菌门相对丰度增加，厚壁菌门、变形菌门相对丰度降低，肠道菌群结构得到改善。

图3 IPTS对AS大鼠肠道菌群的影响Fig.3 Effect of IPTS on intestinal flora of AS rats

3.5 LEfSe分析

LEfSe分析可以用于微生物菌群标记物的筛选。对对照组、模型组以及IPTS中、高剂量组进行LEFSe分析，进一步筛选差异菌属，对差异菌属（LDA≥2）进行Mann-Whitney U检验，并采用Graphpad Prism 7软件对各组在门、科、属水平上的菌属相对丰度差异进行可视化。

3.5.1 门水平肠道菌群相对丰度变化 如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群中脱铁杆菌门、疣微菌门、螺旋体门和变形杆菌门相对丰度明显增高（P＜0.05、0.01），拟杆菌门相对丰度明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，IPTS中剂量组大鼠肠道菌群中疣微菌门、变形杆菌门和拟杆菌门相对丰度明显降低（P＜0.05、0.01），厚壁菌门相对丰度明显升高（P＜0.05）；IPTS高剂量组大鼠肠道菌群中疣微菌门相对丰度明显降低（P＜0.01），变形杆菌门相对丰度显著升高（P＜0.05）。

图4 门水平各组肠道菌群相对丰度Fig.4 Relative abundance of intestinal flora in each group at phylum level

3.5.2 科水平肠道菌群相对丰度变化 如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群中Christensenellaceae、Odoribacteraceae、肠杆菌科、紫单胞菌科、螺旋体科、疣微菌科、瘤胃菌科、脱疏弧菌科、毛螺菌科相对丰度明显增高（P＜0.05、0.01），乳杆菌科、S24-7和普雷沃氏菌科相对丰度明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，IPTS中剂量组大鼠肠道菌群中Marinilabiaceae、脱疏杆菌科、疣微菌科、毛螺菌科相对丰度显著降低（P＜0.05、0.01），鞘氨醇杆菌科相对丰度显著升高（P＜0.05）；IPTS高剂量组大鼠肠道菌群中Marinilabiaceae、脱疏杆菌科、产碱杆菌科、疣微菌科、毛螺菌科相对丰度显著降低（P＜0.05、0.01），鞘氨醇杆菌科和气球菌科相对丰度显著升高（P＜0.05、0.01）。

图5 科水平各组肠道菌群相对丰度Fig.5 Relative abundance of intestinal flora in each group at family level

3.5.3 属水平肠道菌群相对丰度变化 如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群中乳酸杆菌属Lactobacillus和普雷沃氏菌属Prevotella相对丰度显著降低（P＜0.05、0.01），密螺旋体属Treponema、拟杆菌属Bacteroides、Parabacteroides、Akkermansia、颤螺菌属Oscillospira、毛螺菌属Lachnospira、粪球菌属Coprococcus、罗氏菌属Roseburia、大肠杆菌属Escherichia相对丰度显著升高（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，IPTS中剂量组大鼠肠道菌群中埃希菌属、罗氏菌属、毛螺菌属、脱硫叶菌属Desulfobulbus、脱硫弧菌属Desulfovibrio、Akkermansia相对丰度显著降低（P＜0.05、0.01），乳酸杆菌属、布劳特氏菌属Blautia相对丰度显著升高（P＜0.05）；IPTS高剂量组大鼠肠道菌群中毛螺菌属、脱硫叶菌属、脱硫弧菌属、萨特氏菌属Sutterella、Akkermansia相对丰度显著降低（P＜0.05、0.01），布劳特氏菌属相对丰度显著升高（P＜0.05）。

图6 属水平各组肠道菌群相对丰度Fig.6 Relative abundance of intestinal flora in each group at genus level

3.6 PICRUSt肠道菌群功能预测分析

通过STAMP软件的PICRUSt分析各组大鼠肠道菌群的基因功能。部分预测代谢途径结果见图7，发生显著变化的功能主要是细菌运动蛋白、细菌趋化性以及酶水平变化中的药物代谢酶，发生显著变化的代谢通路是核苷酸代谢中的嘧啶代谢和嘌呤代谢、脂质代谢中的甘油磷脂代谢、氨基酸代谢中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、赖氨酸降解。

图7 肠道菌群功能预测结果Fig.7 Result of intestinal flora function prediction

PICRUSt功能预测结果表明，模型组大鼠肠道菌群中的细菌运动蛋白、细菌趋化性指标显著升高（P＜0.01），表明AS大鼠肠道菌群中的微生物过度繁殖，而IPTS可显著减少细菌运动蛋白（P＜0.05），减少病原菌的侵入；模型组肠道菌群中药物代谢相关酶、嘌呤代谢、嘧啶代谢水平显著低于对照组（P＜0.01），表明AS大鼠的核酸代谢受到抑制，经IPTS干预后核酸代谢得到改善。

甘油磷脂由甘油、胆碱、丝氨酸等生成，甘油磷脂代谢属于脂质代谢，其代谢水平上升会导致脂质在血管内沉积，易引发AS等心血管疾病。模型组肠道菌群中的肽聚糖生物合成水平显著下调（P＜0.01），甘油磷脂代谢水平上升；经IPTS干预后，甘油磷脂代谢和肽聚糖生物合成得到改善。与对照组相比，模型组肠道菌群中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢水平显著下降（P＜0.01），缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成水平显著上升（P＜0.05），赖氨酸降解水平上升；经IPTS干预后，上述氨基酸代谢紊乱得到改善。

4 讨论

本研究采用高脂饲养联合ip维生素D3方法建立AS大鼠模型，对大鼠血脂、血管内皮因子（NO、ET-1和Ang-II）和胸主动脉病理变化进行考察，结果显示IPTS能够改善AS大鼠的血管内皮损伤，减少AS斑块，且有一定的调脂作用。采用16S rRNA高通量测序方法分析IPTS对肠道微生物的作用，菌群差异分析和功能分析结果表明IPTS可以改变肠道微生态结构组成，下调致病菌的相对丰度，抑制病原菌入侵以及改善部分肠道菌群基因功能，从而发挥治疗AS的作用。

Emoto等[11]发现AS患者肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门相对丰度增加，拟杆菌门数量减少。另有文献报道厚壁菌门/拟杆菌门相对丰度与血脂变化相关[12]。IPTS组大鼠肠道菌群中拟杆菌门相对丰度降低，厚壁菌门相对丰度升高，表明IPTS可以改善AS大鼠的肠道菌群的结构失衡，调节肠道菌群的组成，从而发挥抗AS的作用。IPTS组大鼠肠道菌群中毛螺菌科相对丰度降低，Koren等[13]发现肠道中毛螺菌科相对丰度与LDL-C、TC水平呈正相关，LDL-C和TC升高会加剧AS，表明IPTS可能通过下调肠道菌群中的毛螺菌科相对丰度调节AS大鼠血脂水平。

肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌可以促进胆固醇排泄，提高机体的抗氧化能力[14-15]，口服益生菌可以预防小鼠AS的发展。王玲等[16]研究表明冠心病患者肠道中的大肠杆菌数量明显增加，AS与致病菌数量上调有关。经IPTS干预后，埃希菌属相对丰度降低，推测IPTS可能通过下调致病菌来改善AS。虽然与对照组相比，模型组布劳特氏菌属相对丰度没有显著变化，但经IPTS干预后，布劳特氏菌属相对丰度增加。Ozato等[17]发现布劳特氏菌属与女性的内脏脂肪面积呈负相关，且与性别无关，表明IPTS抗AS作用可能与上调布劳特氏菌属有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突