秦皮素通过下调p70S6K抑制人黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭研究

兰 楠，吕志阳，周雨晴，韩延南，王明心，彭忠禄*，樊竑冶*

1.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009

2.湘南学院药学院，湖南 郴州 423099

黑色素瘤是一种侵袭性强、致死率高的恶性皮肤癌。转移是造成黑色素瘤致死率高的主要原因之一[1]。黑色素瘤对传统治疗手段易产生耐药性且预后差，其发病率和死亡率逐年升高[2]。虽然近年来靶向治疗和免疫疗法取得了一些进展，但其疗效有限[3-4]，因此亟待开发新的药物和方法治疗黑色素瘤。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是细胞生长和代谢的主要调节因子，可感知和整合多种营养和环境因素来平衡营养供应并调控细胞生长。mTORC1蛋白复合物由mTOR和其他组分组成，具有促进合成代谢的作用，而核糖体蛋白S6的磷酸化常被用来指示mTORC1的活性[5]。mTOR信号转导异常见于多种癌症，并与癌症的耐药性、转移、侵袭及预后等密切相关，S6的过度磷酸化与恶性黑色素瘤显著相关[6]。此外，mTORC1通过激活核糖体S6蛋白激酶（ribosome S6 protein kinase，P70S6K）诱导黑色素瘤发生上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[7]。尽管雷帕霉素已用于治疗胰腺癌，但雷帕霉素、依维莫司和替西罗莫司（mTORC1抑制剂）等在临床试验中缺乏对黑色素瘤的客观反映[8]。

秦皮素是从中药秦皮中提取出的一种天然香豆素类化合物，具有抗菌、抗氧化、神经保护和肿瘤抑制等多种药理学活性，具有良好的药物研究和临床应用价值[9]。秦皮素对乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠腺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移具有明显的抑制或促凋亡作用[10-12]，但其对黑色素瘤细胞的作用鲜有报道。本研究探讨了秦皮素对人黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制，为秦皮素治疗黑色素瘤的临床应用提供理论支持与参考。

1 材料

1.1 细胞

A375细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品与试剂

秦皮素（质量分数＞98%，批号B20990）购自上海源叶生物公司；p70S6K特异性抑制剂PF-4708671（质量分数＞99%，批号HY-15773）购自美国MedChemExpresss公司；DMEM培养基（批号8121025）、胎牛血清（批号2232246）购自美国Gibco公司；Matrigel基质胶（批号9168007）、Transwell小室（批号07920027）购自美国Corning公司；p-mTOR抗体（批号11221）购自美国Signalway Antibody公司；p70S6K抗体（批号2708）、p-p70S6K抗体（批号9234）、S6抗体（批号2217）、p-S6抗体（批号2211）购自美国CST公司；基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）抗体（批号AB92536）购自英国Abcam公司；MMP9抗体（批号00673298）、vimentin抗体（批号6619511）购自美国Affinity Biosciences公司；N-cadherin抗体（批号00059228）、HPR标记的羊抗兔IgG抗体（批号SA00001-4）购自美国Proteintech Group公司；β-actin抗体（批号AB0035）购自上海Abways Technology公司。

1.3 仪器

311型气套CO2培养箱、MSC Advantage 1.5生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE Ts2倒置显微镜（日本Nikon公司）；Mini-Protein Tetra垂直电泳槽、湿式转印槽（美国Bio-Rad公司）；5200 Multi化学发光凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

A375细胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、95%相对湿度、5% CO2恒温培养箱中培养。

2.2 细胞计数法检测细胞增殖

取处于对数生长期的A375细胞，以2.5×105/mL接种至96孔板中，200 μL/孔，培养过夜，待细胞贴壁后加入药物，使秦皮素终浓度为25、50、100、200 μmol/L，对照组加入含有等体积药物溶媒的培养基。每个浓度设置3个复孔，继续培养48 h后，弃去培养基，胰酶消化后用血球计数板对每孔细胞密度进行计数，计算每孔细胞数量。

2.3 细胞克隆形成实验

取处于对数生长期的A375细胞，以500/孔接种于6孔板中，培养48 h后加入药物，使秦皮素终浓度为40、60、80 μmol/L，对照组加入含有等体积药物溶媒的培养基。每3天更换培养基和药物，当培养皿中出现肉眼可见的克隆斑时（约14 d）停止培养；弃去培养液，用PBS溶液洗涤2次后加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫染液染色20 min后流水清洗，待其自然风干后，拍照记录。

2.4 Western blotting实验

收集对照组及不同浓度秦皮素或PF-4708671（10 μmol/L）处理48 h后的A375细胞，加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，经BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液煮沸变性10 min。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入封闭液封闭1 h，分别加入对应的抗体于4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，再加入HPR标记的羊抗兔IgG抗体（1∶10 000）于室温孵育2 h，TBST洗涤3次，滴加ECL化学发光液，采用凝胶成像仪显影。

2.5 细胞划痕实验

A375细胞接种于6孔板，待细胞长满时，用灭菌的200 μL枪头垂直于皿底划线，每孔划3道划痕，PBS清洗3次，加入含1%胎牛血清的DMEM培养基，加入药物使秦皮素终浓度为40、60、80 μmol/L，PF-4708671终浓度为10 μmol/L，对照组加入含有等体积药物溶媒的培养基，继续培养48 h，于显微镜下拍照，使用Image J软件分析0 h和48 h所拍照片的划痕面积，计算划痕愈合率。

划痕愈合率＝(0 h划痕面积－48 h划痕面积)/0 h划痕面积

2.6 细胞侵袭实验

用预冷的DMEM培养基稀释Matrigel基质胶至230 μg/mL，吸取100 μL Matrigel基质胶铺入Transwell上室，于培养箱放置4 h。取处于对数生长期的A375细胞，调整密度为1×106/mL，加入药物使秦皮素终浓度为80 μmol/L、PF-4708671终浓度为10 μmol/L，对照组加入含有等体积药物溶媒的培养基。吸取100 μL上述无血清细胞悬液于Transwell上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的培养基，培养18 h。Transwell小室经4%多聚甲醛固定30 min后，用0.1%结晶紫染液染色20 min，用湿润的棉签擦除Transwell膜上层的细胞，自然风干后，于显微镜下观察并拍照。

2.7 统计学方法

采用GraghPad Prism 8.0软件对数据进行分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验分析。

3 结果

3.1 秦皮素对A375细胞增殖和克隆形成的影响

如图1-A所示，不同浓度秦皮素（25、50、100、200 μmol/L）处理A375细胞48 h后，与对照组比较，秦皮素显著抑制A375细胞的增殖（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。经计算，秦皮素作用于A375细胞48 h的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为98.03 μmol/L，因此选用40、60、80 μmol/L的秦皮素进行后续实验。细胞克隆形成实验结果见图1-B，与对照组比较，秦皮素显著抑制A375细胞克隆形成率（P＜0.01），且呈剂量相关性。表明秦皮素能够抑制A375细胞的增殖和克隆形成能力。

图1 秦皮素对A375细胞增殖 (A) 和克隆形成 (B) 的影响 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of fraxetin on proliferation (A) and clonality (B) of A375 cells (±s, n = 3)

3.2 秦皮素对A375细胞p70S6K/S6信号通路相关蛋白表达的影响

mTORC1/p70S6K/S6信号通路影响细胞的存活、增殖，且该通路在黑色素瘤中异常活化。如图2所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）处理A375细胞48 h后，对mTOR蛋白的磷酸化水平无影响，但显著下调p70S6K及S6蛋白的磷酸化水平（P＜0.01），提示秦皮素可能通过抑制p70S6K/S6信号通路来抑制A375细胞的增殖和克隆形成能力。

图2 秦皮素对A375细胞p70S6K/S6信号通路相关蛋白表达的影响 (±s, n = 3)Fig.2 Effect of fraxetin on p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.3 PF-4708671对秦皮素抑制A375细胞增殖和p70S6K/S6信号通路相关蛋白表达的影响

为探究秦皮素是否通过p70S6K/S6信号通路影响A375细胞增殖，给予秦皮素（80 μmol/L）或p70S6K特异性抑制剂PF-4708671（10 μmol/L）处理细胞48 h，细胞计数结果见图3-A，PF-4708671和秦皮素均可显著抑制A375细胞增殖（P＜0.01）。如图3-B所示，PF-4708671显著上调p70S6K蛋白磷酸化水平（P＜0.01），同时下调S6蛋白磷酸化水平（P＜0.01），与文献报道一致[13]。提示秦皮素可能通过下调p70S6K/S6抑制A375细胞增殖。

图3 PF-4708671对秦皮素抑制A375细胞增殖 (A) 和p70S6K/S6信号通路相关蛋白表达 (B) 的影响 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on proliferation (A) and p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions (B) in A375 cells (±s, n = 3)

3.4 秦皮素对A375细胞EMT相关蛋白表达的影响

mTORC1/p70S6K/S6信号通路与EMT相关，如图4所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）处理A375细胞48 h后，显著下调间质细胞标志物（N-cadherin、vimentin）以及MMP2、MMP9蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通过影响EMT相关蛋白表达抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。

图4 秦皮素对A375细胞EMT相关蛋白表达的影响 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.5 PF-4708671对秦皮素抑制A375细胞EMT相关蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组比较，秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）处理A375细胞48 h后，均显著下调N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通过p70S6K/S6信号通路影响A375细胞EMT相关蛋白表达。

图5 PF-4708671对秦皮素抑制A375细胞EMT相关蛋白表达的影响 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.6 秦皮素和PF-4708671对A375细胞迁移的影响

为探究秦皮素对A375细胞迁移能力的影响，同时避免秦皮素的细胞增殖抑制作用对实验结果的干扰，细胞划痕实验时培养基的血清浓度为1%。如图6所示，经秦皮素（40、60、80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）处理后，A375细胞划痕愈合率显著降低（P＜0.01），提示秦皮素可能通过p70S6K/S6信号通路抑制A375细胞迁移。

图6 秦皮素和PF-4708671对A375细胞迁移的影响 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of fraxetin and PF-4708671 on migration of A375 cells (±s, n = 3)

3.7 秦皮素和PF-4708671对A375细胞侵袭的影响

如图7所示，与对照组相比，经秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）处理后，A375细胞转至Transwell下室的数量显著降低（P＜0.01），且二者联用时转移至下室的细胞进一步减少（P＜0.01），提示秦皮素可能通过p70S6K/S6信号通路抑制A375细胞的侵袭能力。

图7 秦皮素和PF-4708671对A375细胞侵袭的影响 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of fraxetin and PF-4708671 on invasion of A375 cells (±s, n = 3)

4 讨论

黑色素瘤细胞具有增殖速度快、侵袭和转移潜能强、早期易转移等特点。本研究发现，秦皮素通过抑制p70S6K和S6的磷酸化水平，有效地抑制了人黑色素瘤A375细胞的增殖、迁移和侵袭，提示秦皮素有治疗黑色素瘤的潜质。

转移是导致黑色素瘤患者死亡的主要原因。黑色素瘤细胞在转移之前通常会经历EMT，表现为上皮细胞特性逐渐消失，并出现间质细胞特征，而发生EMT的肿瘤细胞更容易发生迁移和侵袭[14]。N-cadherin和vimentin是间质细胞标志蛋白，其蛋白表达水平的升高是细胞发生EMT的重要特征。N-cadherin是一种黏附分子，主要介导细胞与细胞间的动态黏附。N-cadherin表达上调可增强多种上皮癌细胞在体外的迁移和侵袭能力[15-17]。Vimentin是中间纤维蛋白最主要的组成成分，与微管、微丝共同构成细胞骨架，参与调控细胞黏附、细胞形状变化和迁移速度。研究表明，在EMT过程中，vimentin表达增加导致细胞黏附性减弱、细胞形态改变、细胞运动性增强[18]。MMP2和MMP9可促进基底膜以及胞外基质中明胶和胶原蛋白降解，增强细胞侵袭能力；在发生EMT的黑色素瘤细胞中，MMPs表达上调[19]。本研究发现，秦皮素抑制了A375细胞中N-cadherin、vimentin、MMP2和MMP9蛋白表达，提示秦皮素可能通过抑制A375细胞的EMT来抑制细胞的迁移和侵袭，从而阻止黑色素瘤细胞转移。

p70S6K是属于AGC激酶家族的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以被不同的生长因子或胰岛素样因子通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/mTOR通路磷酸化[20]。S6是核糖体40S亚基的重要蛋白质组成成分，是p70S6K激酶下游的重要靶蛋白。p70S6K/S6信号通路对肿瘤细胞的增殖、存活、细胞周期进展等有重要作用。抑制p70S6K可抑制乳腺癌细胞迁移[21]；敲除p70S6K会抑制神经胶质瘤细胞增殖及裸鼠中肿瘤形成[22]；敲除S6可以抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭[23]。本研究发现，秦皮素以p-mTOR非依赖性的方式下调了p70S6K和S6的磷酸化水平。为研究秦皮素对A375细胞的作用是否依赖于p70S6K激酶活性，使用p70S6K的特异性抑制剂PF-4708671进行对照实验，发现PF-4708671上调了p70S6K蛋白的磷酸化水平，下调了S6蛋白的磷酸化水平，与文献报道一致[13]；PF-4708671抑制了A375细胞的增殖、迁移、侵袭，与秦皮素效果类似，表明秦皮素可能通过p70S6K/S6信号通路抑制A375细胞的增殖、迁移和侵袭。

p-mTOR上调表明mTORC1活性增加，mTORC1可以直接磷酸化下游蛋白p70S6K。本研究结果显示，秦皮素上调p-mTOR蛋白表达，下调p-p70S6K和p-S6蛋白表达。由于蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）是mTOR的上游激酶，而p-S6能够负反馈抑制Akt活性[24]，因此当秦皮素下调p-S6表达后，其对Akt的负反馈抑制作用解除，导致mTOR被活化即p-mTOR上调。推测秦皮素可能通过与mTOCR1或其调控因子结合而抑制mTOCR1活性，从而影响其对p70S6K的磷酸化；秦皮素在抑制mTORC1活性的同时累积了mTOR在S2448位点的磷酸化。秦皮素对mTORC1/p70S6K/S6信号通路的具体调控机制仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突