基于ITS2条形码鉴别南大青叶的PCR-RFLP研究

黄韵璇，朱晓燕，侯惠婵，陈伟盛

广州市药品检验所 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广东 广州 510000

历史上使用的“大青叶”来源有4个基原，分别为十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥叶、蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctoriumAit.的干燥叶、爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek.的干燥叶、马鞭草科大青Clerodendrum cyrtophyllumTurcz.的干燥叶。其中，菘蓝的干燥叶和蓼蓝干燥叶分别以“大青叶”和“蓼大青叶”收载在《中国药典》2020年版；马蓝干燥叶以“大青叶”收载在《四川省中药材标准》1987年版和《广东省中药炮制规范》1984年版；大青干燥叶以“大青叶（马大青叶）”收载在《湖南省药材标准》2009年版。在《中国药典》2020年版一部中，菘蓝的干燥根和干燥叶分别被收载为“板蓝根”和“大青叶”[1]，而马蓝的干燥根茎和根被收载为“南板蓝根”[1]，本实验所述“南大青叶”为爵床科植物马蓝的干燥叶。

马蓝为草本植物，主要分布于我国华南、西南和华东地区，由于马蓝产量限制与各地区的使用习惯不同，市售的南大青叶易为同科混伪品（如球花马蓝叶、广西马蓝叶、疏花马蓝叶、少花马蓝叶等）或不同科属的大青叶和菘蓝叶等[2]。传统的显微鉴别和化学鉴别易受基原植物的生长环境影响[3]，而且对操作人员的技术背景有一定要求，鉴别结果准确度不高。因此，采用基于DNA条形码（DNA barcoding）技术的分子鉴别方法作为传统鉴别手段的补充，可以有效降低南大青叶的鉴别难度，加强基原物种马蓝相关药材、饮片和中成药的质量监管，提高民众用药安全[4]。

DNA条形码技术是通过一段短的、标准的DNA序列进行物种鉴定的分子技术，鉴定结果不受物种个体形态特征和发育阶段的影响，操作流程简单规范，不过度依赖操作人员的经验，经过近些年的发展已广泛应用于海关、法医、动植物检验检疫、食品、药品及化妆品检测等多个领域[5]。在中药材鉴定方面，陈士林团队创建了基于ITS2、psbA-trnH、COI的DNA条形码生物鉴定体系[6]，并且该方法已纳入《中国药典》2020年版，收载的中药材中，川贝母的鉴别项下包含了基于ITS1条形码测序分析的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法[1]。该方法是针对限制性酶切位点限制性片段长度变异的一种常用的生物基因型鉴定方法，它在PCR的基础上利用限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳检测能准确区别川贝母与其混伪品。

参照《中国药典》2020年版四部中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则，选用ITS2序列为主体序列，以叶绿体psbA-trnH为辅助序列，对36批南大青叶样品进行序列比对，探索马蓝与其近缘种在分子水平上的差异。并且，通过分析马蓝及其近缘物种的DNA条形码位点差异，建立南大青叶基于ITS2基因和限制性内切酶Sma I的PCR-RFLP鉴别方法。

1 材料与仪器

1.1 材料

本实验用36批南大青叶药材信息见表1。其中，阳性对照药材P2～P4和P6～P15为自采样本，经广州市药品检验所中药室侯惠婵主任中药师鉴定为马蓝B.cusia(Nees) Bremek.；阴性对照药材N14、N16～N21样品分别为爵床科垂序马蓝Strobilanthes japonicus(Thunb.) Miq.、爵床科艳芦莉Ruellia elegansPoir.、爵床科翠芦莉R.simplexC.Wright.、爵床科狗肝菜Dicliptera chinensis(L.) Juss.、爵床科云南山壳骨Pseuderanthemum crenulatu(Wallich ex Lindley) Radlkofer.疑似品、马鞭草科大青C.cyrtophyliumTurcz.和十字花科菘蓝I.indigoticaFortune.。

表1 36批南大青叶样品编号和来源信息Table 1 Serial number and source of 36 batches of materials

1.2 仪器和试剂

SIGMA 1-14K型高速离心机（美国SIGMA公司）；水浴摇床WNB14（德国Memmert公司）；PCR扩增仪9700（美国AB Applied Biosystems公司）；分析天平PM200（瑞士Mettler Toledo公司）；凝胶成像系统GelDoc XR＋（美国Bio-Rad公司）；组织粉碎仪pulverisette23（德国IKA公司）。

植物基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Ki（QIAGEN）；PrimeSTAR Max Premix（Takara Bio）；DL 2000 DNA Marker（Takara Bio）；Gelred染料（Biotium）；Sma I Fastdigest（ThermoSciense）；ITS2序列正向引物ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’（华大基因）；psbA-trnH序列正向引物psbAF：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，反向引物trnHR：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’（华大基因）。

2 方法

2.1 DNA的提取

取样品约20 mg，置组织粉碎仪中制成细粉，按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA。

2.2 PCR扩增

扩增ITS2和psbA-trnH分别使用ITS2R/ITS3F和fwd/rev引物对，反应总体积为20 μL，DNA模板加入量为0.5～1.0 ng，反应参数为98 ℃预变性30秒，循环反应30次（98 ℃、10 s，56 ℃、15 s、72 ℃、20 s），72 ℃延伸5 min。

2.3 测序与比对分析

将PCR产物委托华大基因进行正反向测序，测序引物为PCR反应引物。获得的双向测序峰图文件利用SeqMan软件进行序列拼接，再去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域，使序列方向与PCR扩增正向引物方向一致。拼接的序列使用基于隐马尔科夫模型的 ITS2注释网站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）进行标注[7]，再在MEGA 10.0.5软件上采用Clustal W方法比对分析样品序列，绘制Neighbor-joining（N-J进化树）。

2.4 Sma I酶切反应

酶切反应总体积为20 μL，反应体系包括10×酶切缓冲液2 μL，PCR反应液10 μL，Sma I 0.5 μL，无菌水7.5 μL，反应在37 ℃水浴进行。

3 结果与分析

3.1 南大青叶及其混伪品的DNA条形码鉴定

参照《中国药典》2020年版四部通则9107中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则，选用ITS2为主体序列，叶绿体psbA-trnH为辅助序列对36批样品进行分子鉴定。所有样品的DNA条形码片段均成功扩增，psbA-trnH测序得到约510 bp的序列信息，而含有重复GC片段的ITS2序列难以测通，经过拼接和去除信号弱的区域仅得到大小约为300 bp、包含28S motif区域的片段序列。

将所有样品ITS2基因的可测序部分的序列用Clustal W方法分析比对绘制N-J进化树（图1），再将样品序列输入NCBI数据库进行BLAST比对（表2），结果显示P1～P15样品与马蓝的相应序列完全一致；N1～N10样品与马蓝的ITS2序列存在位点差异，相似度为96%；N13～N15样品与马蓝ITS2序列的差异位点较多，相似度为93%，而且在进化树上表现为属于P1～P15和N1～N12的外群；N16～N21样品与其他物种ITS2序列较一致，与马蓝的序列差异较大。另外，将P1～P15、N1、N3、N9、N15样品的psbA-trnH序列进行比对，P1～P15与N9无位点差异，N1、N3、N15与其他序列仅有2个位点的差异，说明psbA-trnH不适用于马蓝鉴定。因此，上述36批样品按中药材DNA条形码分子鉴定，P1～P15的物种鉴定为马蓝，为南大青叶正品，N1～N15的物种鉴定为马蓝同科近缘物种，为南大青叶混伪品，N16～N21为其他科属物种，为南大青叶混伪品。

表2 36批样品ITS2部分序列的BLAST比对结果Table 2 BLAST result based on part of ITS2 sequeces of 36 samples

图1 基于36批样品部分ITS2序列的N-J进化树Fig.1 N-J tree based on part of ITS2 sequences of 36 samples

3.2 南大青叶PCR-RFLP法鉴别方法建立

根据所有样品ITS2的测序结果，南大青叶正品比对混伪品有2个稳定的关键差异位点（图2），其中一个位点在限制性内切酶Sma I的识别区域CCCGGG中，即南大青叶ITS2基因扩增产物约500 bp，经Sma I酶切可形成2条大小分别约为200 bp和300 bp的DNA片段，以此可建立相应的南大青叶PCR-RFLP鉴别方法。另外，按中药材DNA条形码鉴定指导原则采用56 ℃退火温度扩增南大青叶样品的ITS2基因，扩增产物在300 bp位置有非特异性条带影响酶切后目的条带的观察，因此使用58 ℃的退火温度进行PCR-RFLP反应更适用于南大青叶的鉴别。

图2 限制性内切酶Sma I在马蓝ITS2基因序列中的识别位点示意图Fig.2 Recognition site of restriction enzyme Sma I in ITS2 sequences of B.cusia and its adulterants

3.3 南大青叶PCR-RFLP法鉴别方法验证

按《中国药典》2020年版四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则分别考察上述PCRRFLP鉴别方法的专属性和耐用性。

3.3.1 专属性试验 按“2.1”“2.2”项对36批样品进行DNA提取，利用PCR反应扩增样品ITS2基因，退火温度为58 ℃，然后用Sma I Fastdigest酶切PCR产物，反应15 min，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，南大青叶正品P1～P15在200～300 bp位置有2个明亮的酶切的条带，均呈阳性反应；南大青叶混伪品N1～N21和空白对照在200～300 bp处无条带，均呈阴性反应（图3）。结果说明上述PCR-RFLP方法用于鉴别南大青叶符合《中国药典》2020年版四部9101专属性的要求。

图3 36批南大青叶样品PCR-RFLP鉴别结果Fig.3 Identification result of 36 batches of samples with PCR-RFLP method

3.3.2 耐用性试验 取3批南大青叶正品和3批南大青叶混伪品按上述PCR-RFLP反应进行鉴别，分别使用与专属性试验不同的植物DNA提取试剂盒（北京天根、北京中科瑞泰）、ITS2通用引物（Invitrogen）、退火温度（60 ℃）、DNA聚合酶（Promega GoTaq®DNA聚合酶、Promega Taq DNA聚合酶）、Sma I限制性内切酶（Promega、ThermoSciense）和1 h酶切反应时间，各反应体系与条件参考商品化试剂说明书。结果显示，所有样品的在500 bp的位置均有PCR产物条带；南大青叶正品的酶切产物在200～300 bp位置有2个酶切条带，呈阳性反应；南大青叶混伪品无酶切条带，呈阴性反应（图4）。因此，上述PCR-RFLP方法用于鉴别南大青叶符合《中国药典》2020年版四部9101耐用性的要求。

图4 PCR-RFLP法鉴别南大青叶的耐用性考察Fig.4 Robustness of PCR-RFLP identification method with B.cusia

4 讨论

本实验针对南大青叶鉴别建立的PCR-RFLP方法是基于DNA分子条形码ITS2的分析应用。经过对36批中药材南大青叶及混伪品的序列分析，南大青叶所属物种马蓝的ITS2序列与疏花马蓝、关节马蓝、垂序马蓝等近缘物种的有明显的位点差异，与艳芦莉、翠芦莉、狗肝菜、云南山壳骨、大青和菘蓝等混伪品的有较大种间差异。而且，黄志海等[8]分析马蓝、菘蓝、蓼蓝和大青的ITS2条形码序列，结果发现4个物种在N-J进化树上也能明显区分。因此，ITS2作为鉴定马蓝的DNA分子条形码具备良好的适用性。凃媛[9]针对马蓝、蓼蓝和菘蓝等含靛玉红类中药材的4种DNA条形码序列进行了扩增分析，结果发现ITS2序列的扩增效率及测序成功率较低，进而采用T-A克隆法获得高质量测序结果。蒋超等[10]采用碱裂法提取各类药材DNA发现来自植物叶样品的DNA纯度比根和茎的较高，但PCR扩增效率最低。本研究采用硅胶膜吸附柱和离心柱法提取干燥叶样品中的基因组DNA，经紫外分光光度计测定所得DNA溶液纯度较低，在260 nm吸光度值较大，直接用作模板会影响扩增效率或导致扩增失败。但是，用适量无菌纯化水将模板DNA稀释后再加入PCR反应体系中，所有样品的ITS2序列均能成功扩增，表明采用简单的稀释模板步骤可提高中药材DNA序列的扩增效率，减少植物中多糖、多酚和部分次级代谢产物对扩增反应的抑制作用。

在《中国药典》2020年版一部的收载品种中，南板蓝根为马蓝的干燥根茎或根，青黛为马蓝、蓼蓝或菘蓝的叶或茎叶经加工制成的干燥粉末、块团或颗粒，二者采用的鉴别方法为显微鉴别、化学鉴别和针对靛蓝与靛玉红的薄层色谱法[1]。本研究建立的PCR-RFLP法对马蓝物种的鉴别具有良好的专属性和耐用性，因此同样适用于鉴别南板蓝根，方法快捷高效，结果准确，有效弥补了传统的鉴别手段主观性强、准确性低、样品用量大等不足。同时，魏艺聪等[11]通过对20条样本信息的SNP分析发现matK序列可以用于鉴别马蓝和大青，但本研究表明马蓝与其近缘物种的psbA-trnH基因不存在明显的变异位点，因此基于DNA条形码分子技术建立相应的鉴定体系，在鉴别中药材青黛方面也有着重要的应用前景。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突