基于SCoT分子标记的金花茶组植物种质资源遗传多样性分析

卢家仕，李先民，黄展文，余海娟，李春牛，苏 群，卜朝阳

广西壮族自治区农业科学院 花卉研究所，广西 南宁 530007

金花茶Camellia nitidssimaChi.是山茶科（Theaceae）山茶属CamelliaL.金花茶组植物，是具有金黄色花的山茶属植物代表，属国家一级珍稀保护植物。金花茶主要分布于我国广西南部和越南北部，地处亚热带南缘和热带北缘的热带季风气候区，自1960年首次在广西发现以来，已知的金花茶有42种5变种，其中广西南部及西南部产29种5变种，云南、贵州、四川各产1种，越南北部产10种。金花茶是世界珍贵稀有的观赏植物和种质资源，被誉为“茶族皇后”“植物界中的大熊猫”和“幻想中的黄色山茶[1-3]。金花茶花朵金黄色，具蜡质光泽，是培育黄色茶花的优良亲本[4]。金花茶的花朵和叶片中含有类黄酮、茶多酚及茶多糖等多种化学活性成分，也含有丰富的蛋白质、人体必需的氨基酸及微量元素，具有调血脂、降血糖、降血压和抗癌等药用功效和重要的保健价值[5-8]。

目前对金花茶的研究主要集中在地理分布[9-10]、引种栽培[11-12]、繁殖方式[13-16]、化学成分[17-18]、基因克隆[19-20]等研究。随着分子生物学的发展，分子标记技术在植物种植资源分类、品种鉴定、遗传多样性分析中发挥着重要的作用。分子标记技术在金花茶组植物种质资源中的应用主要如下：施苏华等[21]筛选14个随机扩增多态性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）引物分析11种金花茶植物间的遗传相似性，并构建了系统发育树状分支图；张玥等[22]用简单重复序列区间（intersimple sequence repeats，ISSR）分子标记方法对云南大围山金花茶及广西金花茶种质资源进行亲缘关系分析，结果表明广西金花茶与云南金花茶分为2类，而且亲缘关系较远，云南大围山金花茶可进一步细分为2个亚类；李辛雷等[23]用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子标记技术，对4个金花茶种群进行遗传多样性和遗传结构分析，结果表明金花茶种群内遗传变异为81.52%，种群间遗传变异为18.48%，遗传变异主要存在于种群内，种群间遗传变异与其地理距离无明显相关性；刘凯等[24]用SNP标记技术从基因组水平揭示不同地区金花茶种质遗传关系，结果可分成2个大的类群；陈莉萍等[25]用简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）分子标记技术分析平果金花茶具有中等程度的遗传多样性和高水平的遗传分化，种群内遗传变异达74.69%，种群间的遗传变异为25.31%。

SCoT（start codon targeted polymorphism）为目标起始密码子多态性标记，该标记具有操作简单、重复性好等特点，可作为RAPD、ISSR等传统分子标记的有效补充[26]。目前已广泛应用在杨桃[27]、砂糖桔[28]、丝瓜[29]等作物的遗传多样性分析中。目前，未见有利用SCoT分子标记技术对金花茶进行遗传多样性分析的报道。利用SCoT分子标记技术分析不同金花茶组植物种质资源的遗传多样性和亲缘关系，为金花茶组植物种质资源鉴定保护和开发利用提供理论参考依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

27份试验的金花茶组植物种质资源种植在广西农业科学院花卉研究所金花茶种质资源圃内。材料由广西农业科学院花卉研究所卜朝阳研究员和卢家仕副研究员共同鉴定，鉴定结果见表1。实验材料统一采集新鲜的嫩叶，先用自来水清洗干净，再用去离子水清洗一遍，最后用滤纸吸干水分后提取植物基因组总DNA。

表1 实验材料Table 1 Test materials

1.2 主要仪器与试剂

HWS-26型电热恒温水浴锅（北京海天友诚科技有限公司）；FM130型雪花制冰机（北京长流科技有限责任公司）；H1650-W型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MINI-4K微型离心机（杭州米欧仪器有限公司）；MixMate PBC-115353混匀仪（Eppendorf公司）；Nano Drop One核酸蛋白测定仪（美国Nano Drop产品）；LifeECO基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）；DDY-60型电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYCP-31DN型电泳槽（北京市六一仪器厂）；BIO-RAD凝胶成像系统（美国产品）。Biospin全能型植物基因组DNA试剂盒、2×Es Taq Master Mix（杭州博日科技有限公司）；RNase A（天根生化有限公司）；Gold View I型核酸染色剂（北京索莱宝科技有限公司）；DL5000 Maker（Takara公司）；Biowest琼脂糖（西班牙原装）；超纯水、50×TAE concentrate Solution缓冲液（南宁国拓生物科技有限公司）；SCoT引物由北京擎科生物科技有限公司（广州分公司）合成。

2 方法

2.1 DNA提取与检测

金花茶组植物DNA参照Biospin全能型植物基因组DNA试剂盒说明方法提取。DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop One核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度，每个DNA浓度统一用超纯水稀释为10 ng /μL后放-20 ℃冰箱保存备用。

2.2 引物筛选与SCoT-PCR扩增

用平果金花茶（广西）和黄抱茎金花茶（越南）2份DNA样品代表进行引物初筛选，从中筛选扩增产物多态性好、重复性高、条带清晰的引物。SCoTPCR 20 μL反应体系如下：DNA 1 μL、超纯水8 μL、2×Ex Taq Mix 10 μL、SCoT引物1 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，扩增进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min，产物于4 ℃保存。取7 μL PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用BIO-RAD凝胶成像系统检测和拍照保存。

2.3 数据统计分析

SCoT-PCR扩增产物按同一迁移水平下条带的有无分别赋值，有条带记为“1”，无条带记为“0”，采用人工读取和统计条带。将[0，1]数据矩阵导入NTsys 2.10e软件中，用DICE法计算遗传相似系数，用UPGMA法构建聚类树状图。

3 结果与分析

3.1 SCoT引物筛选与扩增结果

从100条SCoT引物中筛选出13条多态性高、条带清晰的引物共扩增出566条条带，其中多态性条带549条，多态性比率为97%，平均每条SCoT引物扩增的总条带数和多态性条带数分别为43.54和42.23条，多态性比率为89.74%～100.00%，平均为96.82%（表2）；扩增片段大小为250～5 000 bp，以500～3000 bp居多，图1、2分别是引物SCoT 34和SCoT 40对不同金花茶组植物种质资源的DNA扩增结果。

表2 13个SCoT引物的扩增结果Table 2 Amplification results of thirteen SCoT primers

图1 引物SCoT 34对27份金花茶组植物种植资源的SCoT分子标记扩增结果Fig.1 Amplification result of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer SCoT 34 by SCoT molecular marker

图2 引物SCoT 40对27份金花茶组植物种植资源的SCoT分子标记扩增结果Fig.2 Amplification result of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer SCoT 40 by SCoT molecular marker

3.2 遗传相似性分析

利用NTSYS 2.10e软件DICE法计算13条SCoT引物扩增结果，导出了在0.367～0.754，获得了遗传相似性矩阵（表3）。2个不同种质间的遗传相似系数越大说明材料间的亲缘关系越近，相反，2个不同种质间的遗传相似系数越小说明材料间的亲缘关系越远。龙州金花茶和毛籽金花茶之间的相似系数最大，为0.754，其亲缘关系最近，普通金花茶和罗斯曼金花茶之间的相似系数最小，为0.367，其亲缘关系最远。

表3 27份金花茶组植物种质资源的遗传相似系数Table 3 Genetic similarity coefficients of 27 Camellia sect. chrysantha Chang germplasm resources

3.3 聚类分析

通过非加权平均距离法（UPGMA）聚类分析，构建27份金花茶组植物种质资源的聚类树状图（图3）。由图可见，13条SCoT引物的扩增结果在遗传相似系数0.480处聚为5组，分别是I、II、III、IV、V组。第I组有8个金花茶种质，在遗传相似系数0.511处第I组被分为a、b 2个亚组，其中a亚组包括普通金花茶和毛瓣金花茶2个种质，b亚组包括小花金花茶、东兴金花茶、薄叶金花茶、凹脉金花茶、中东金花茶和显脉金花茶6个种质。第II组有5个金花茶种质，在遗传相似系数0.517处第II组被分为c、d 2个亚组，其中c亚组包括黄抱茎金花茶和隆安金花茶2个种质，d亚组包括扶绥金花茶、大叶显脉金花茶和小叶显脉金花茶3个种质。第III组有夏石金花茶、红顶金花茶和多毛金花茶3个种质。第IV组有10个金花茶种质，在遗传相似系数0.508处第IV组被分e、f 2个亚组，其中e亚组只有顶生金花茶1个种质，f亚组包括崇左金花茶、龙州金花茶、毛籽金花茶、陇瑞金花茶、弄岗金花茶、平果金花茶、柠檬黄金花茶、库克芳金花茶和天鹅金花茶9个种质。第V组只有罗斯曼金花茶1个种质，与其他种质资源之间遗传相似系数在0.367～0.509，其遗传相似系数与普通金花茶的最小，为0.367，与凹脉金花茶的最大，为0.509。

图3 27份金花茶组植物材料的UPGMA聚类树状图Fig.3 UPGMA dendrogram of 27 plants of Camellia sect.chrysantha Chang germplasms resources

4 讨论

SCoT分子标记是一种根据起始密码子ATG侧翼序列的保守性和一致性设计单向引物，扩增产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记[30]，其操作简单、多态性高、重复性好、引物通用性强，能有效产生与性状连锁的位点，可检测出不同基因型供试材料间的微小差异，准确反映种质间亲缘关系[31]。本研究用13条引物对27份金花茶种质进行PCR扩增，共扩增出566条条带，其中多态性条带549条，多态性比率为97%。宾晓芸[32]用ISSR、RAPD和AFLP 3种分子标记方法揭示了金花茶物种的遗传多样性水平，ISSR、RAPD和AFLP多态位点百分数分别为75.2%、79.7%、80.73%。陈莉萍等[25]用8对SSR引物对7个野生代表种群，共216个个体扩增获得多态性条带比率为94.64%。SCoT分子标记多态性比ISSR、RAPD和AFLP的高，与SSR分子标记接近。传统分子标记较稳定、可靠、操作简便，不受外部环境条件干扰，但也存在一些缺点，如AFLP分子标记需要高质量的DNA模板及制胶技术，RAPD分子标记重复性较差，SSR和cqSSR分子标记的引物开发较困难[33]。SCoT分子标记可作为ISSR、RAPD和AFLP的有效补充[26]。本研究结果发现金花茶组植物基因组有较高的多态性，可用于该类植物种质鉴定、遗传多样性分析及指纹图谱构建，这些多态性位点信息很可能是一些功能基因或与目标性状相关联，可为基因定位和基因克隆提供理论参考依据。

第I组8个金花茶种质中，a亚组普通金花茶和毛瓣金花茶相近，b亚组小花金花茶与东兴金花茶相近，薄叶金花茶与凹脉金花茶相近，中东金花茶与显脉金花茶相近，第I组的聚类结果与叶创兴等[34]研究结果相似，如普通金花茶、凹脉金花茶与显脉金花茶相近，毛瓣金花茶、薄叶金花茶与小花金花茶相近；小花金花茶与中东金花茶聚为一组与张宏达[35]、施苏华等[36]的研究结果相似，不同的是本组不包括扶绥金花茶；毛瓣金花茶与东兴金花茶聚为一组与肖政等[37]的研究结果相似，不同的是其还包括薄瓣金花茶与东兴金花茶相近，但这两者的差异大。

第II组5个金花茶种质中，黄抱茎金花茶和隆安金花茶相近，区别在于前者嫩叶紫红色，叶基部呈耳状抱茎，嫩枝光滑无毛[38]，隆安金花茶花期较早，每年11月底始开；大叶显脉金花茶和小叶显脉金花茶遗传相似系数较高，为0.749，扶绥金花茶与这两者相近，而扶绥金花茶嫩叶淡红色，嫩枝淡紫红色。第III组3个金花茶种质中，红顶金花茶和多毛金花茶遗传相似系数较高，为0.626，两者都是越南种，区别在于红顶金花茶花色金黄，花大，产量高，具有较好的耐晒性[39]，多毛金花茶花色淡黄，花瓣无蜡质，嫩枝有浓密绒毛[38]，夏石金花茶与这两者相近，而不与小花金花茶相聚，这个研究结果与肖政等[37]的研究结果不一致，与梁盛业[1]的两者分开分类相似，夏石金花茶与小花金花茶花形态近似，但夏石金花茶叶片比较宽长，子房无银灰色短柔毛，其可能原因是SCoT分子标记扩增产生偏向于候选功能基因区的显性标记，红顶金花茶、多毛金花茶和夏石金花茶之间可能有共同的性状连锁位点，聚类分析表现为亲缘关系较近。

第IV组10个金花茶种质中，龙州金花茶和毛籽金花茶遗传相似系数最高，为0.754，陇瑞金花茶和弄岗金花茶与龙州金花茶、毛籽金花茶聚为小组，结果与闵天禄等[40]将毛籽金花茶、弄岗金花茶、大样弄岗金花茶、大茶金花茶、陇瑞金花茶归并到淡黄金花茶的观点相似，与施苏华等[36]的4个聚为一组研究结果一致。平果金花茶与柠檬黄金花茶聚在一起，遗传相似系数较高，为0.698，结果与叶创兴等[34]研究结果相似。顶生金花茶花大，多单生于小枝顶端，其习性和叶形特征与平果金花茶十分相似[23]。陇瑞金花茶与柠檬黄金花茶、天鹅金花茶同为f亚组，结果与肖政等[37]的研究结果聚为A类相似。库克芳金花茶为越南引进种，与柠檬黄金花茶相近，遗传相似系数较高，为0.583，区别在于库克芳金花茶长势旺，一年可多次抽稍。第V组只有罗斯曼金花茶1个越南种质，与其他种质资源差异较大，可以作与为其他种质远缘杂交的资源。

不同金花茶组植物种质间的遗传多样性丰富，SCoT分子标记多态性高，重复性好，可有效用于金花茶组植物种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，为金花茶组植物种质资源的鉴定保护、分子辅助育种和开发利用提供理论参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突