基于熵权-正态云模型的多产地蓬莪术质量评价研究

林 薇 ，朱宗萍 ，廖 婉 *，杨青松 ，高天慧 ，陈 意 ，裴 瑾 ，邓 彬，林丽婷 ，赵 萱 *

1.成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137

2.成都中医药大学管理学院，四川 成都 611137

3.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

4.成都地奥制药集团有限公司，四川 成都 610065

蓬莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulisVal.的干燥根茎，具有行气破血、消积止痛的功效，主治癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛和食积胀痛[1]。莪术始见于《药性论》，古名蓬莪茂[2]。苏颂曰“蓬莪茂古方不见用者。今医家治积骤诸气为最要之药”。现代研究表明莪术具有抗肿瘤、抗肝炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血糖等药理作用，其主要活性物质是姜黄素类和挥发油类[3]。其中挥发油类成分主要为吉马酮、呋喃二烯、莪术醇、β-榄香烯等[4]；姜黄素类成分主要为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素等[5]。

作为中医临床常用药，蓬莪术药材产地较广。《本草图经》记载“蓬莪茂，生西戎及广南诸州，今浙江或有之。三月生苗，在田野中。”《药物出产辨》记载“蓬莪术，产四川为正地道[6]。随着历史进程的演变，目前蓬莪术大多产于四川、广西、云南等地，福建、广东也有少量分布。由于蓬莪术产地地域分布较广，且不同气候、土壤和栽培条件等因素对其质量均具有一定的影响，因此有必要对不同产地的蓬莪术质量进行评价，为其临床用药的有效性提供科学依据。

近年来，借助现代化的分析手段，如GC-MS、HPLC、UPLC、UV等，获取中药复杂的化学数据，是中药材质量评价较为通用的方法。其中，多指标成分含量测定及中药指纹图谱，为中药饮片质量评价研究提供示范[7]。采用模式识别的理论方法，如灰色关联度模型、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等化学模式识别法对数据进行特征提取，进而对药材进行鉴别和分析，是目前最广泛的中药质量评价方法[8]。但现有统计模式识别，如灰色关联度主要是对相似程度的指标进行关联度分析[9]，PCA把相关指标重新组合成无关的一组综合指标[10-11]，HCA则是依据实验数据进行分组归类[12-13]，都没有考虑到实验数据质量等级划分的模糊性和随机性，具有一定的局限性。

熵权-正态云模型是一种模糊模式识别，以模式信息的隶属关系为依据，建立隶属度函数，计算样本的隶属度，实现对模糊子集、模糊特征和模糊关系的分析，产生分类和决策，在系统模糊性、随机性等方面的评价具有较高的适应性[14]，不仅利用了信息熵值计算不同指标的权重，保证了权重的客观性和准确性，还通过云发生器将定性概念转化为定量分析，使结果具有更强可靠性[15]。使用MATLAB进行数据分析和模型拟合，通过熵权-正态云模型比较不同产地化合物含量来对蓬莪术质量进行评价，从数理统计的视角构建中药材宏观质量评价的方法，是中药材质量评价中一种创新，为中药材质量评价提供新思路。

1 材料与仪器

1.1 材料与试药

各产地蓬莪术均各收集3个批次，包含道地药材产地四川省，以及其他产区云南省和广西省。具体信息见表1。各产地蓬莪术分别经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为蓬莪术C.phaeocaulisVal.。

表1 蓬莪术的产地和批号Table 1 Origin and batch number of C.phaeocaulis

姜黄素（批号wkq19012802）购于四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数≥98%；吉马酮（批号J27J9T66646）购于上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%；莪术醇（批号CHB180803）购于成都克洛玛生物科技有限公司，质量分数≥98%；呋喃二烯（批号111824-201102）购于中国食品药品检定研究院，质量分数≥99.4%。乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）、磷酸（成都市科龙化工试剂厂，色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Ulti Mate 3000型超高效液相色谱仪（UPLC，美国Thermo Fisher公司）；Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Thermo Fisher公司）。

2 方法

2.1 指标成分的测定

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称定吉马酮、呋喃二烯、莪术醇和姜黄素适量于10 mL量瓶中，加甲醇振摇后定容，得到质量浓度为0.253、0.241、0.228、0.257 g/L的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取各产地蓬莪术饮片适量，粉碎，过5号筛，精密称定粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇10 mL，称定质量，超声处理1 h，取出，称定质量并补足减失质量，摇匀，静置，上清液以0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 采用Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.5 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，5%～25% A；2～5 min，25%～30% A；5～25 min，30%～55% A；25～50 min，55%～70% A；50～52 min，70%～5% A），体积流量0.3 mL/min，柱温35 ℃，检测波长214 nm，进样量2 μL。混合对照品和样品的色谱图如图1所示。

图1 混合对照品 (A) 和莪术饮片样品 (B) 的UPLC图谱Fig.1 UPLC of mixed reference substances (A) and Curcumae Rhizoma (B)

2.1.4 线性关系的考察 取 “2.1.1”项下混合对照品溶液，倍比稀释得系列混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，得到姜黄素回归方程Y＝215.5X＋0.224 9，r2＝0.999 7，线性范围为3.97～254.00 μg/mL；莪术醇回归方程Y＝43.47X＋0.037 8，r2＝0.999 8，线性范围为3.75～240.00 μg/mL；吉马酮回归方程Y＝305.83X＋0.865 2，r2＝0.999 5，线性范围为3.58～229.00 μg/mL；呋喃二烯回归方程Y＝263.81X＋0.556 5，r2=0.999 9，线性范围为4.02～257.00 μg/mL。由结果可知，4种成分在线性范围内均呈现良好的线性关系。

2.1.5 重复性试验 精密称取供试品溶液6份，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，结果姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯质量分数的RSD均小于2%，表明本方法重复性良好。

2.1.6 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，结果姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1 μL，分别在0、2、4、8、16、24 h，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，结果姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯峰面积的RSD均小于1.5%，表明样品稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已测定的样品粉末0.50 g，共6份，分别加入一定量的对照品，按“2.1.2”项下要求制备各供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，结果姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯峰面积的平均加样回收率分别为114.65%、102.23%、111.15%、111.73%，RSD分别为0.20%、0.19%、0.16%、0.11%，表明本方法准确可靠。

2.1.9 样品测定 注入超高效液相色谱仪测定吉马酮、呋喃二烯、莪术醇和姜黄素的含量[16]。每个批号平行制备3批样品进行测定。

2.2 熵权-正态云模型

2.2.1 熵权法 熵权法是客观赋权法的一种，在Shannon引入信息论后，称之为信息熵[17]。主要是通过指标的观测值所提供的信息来确定权重，避免主观因素造成的误差。

（1）构建归一化判断矩阵：假设有m个评价对象，n个评价指标，原始判断矩阵为（Xij），其中Xij表示第i（i＝1，2，…，m）个评价对象的第j（j＝1，2，…，n）个评价指标的值，由公式（1）得到归一化矩阵（Pij）。

（2）计算指标的信息熵值与权重：设第j项指标的信息熵值为Ej，根据公式（3）可计算出第i个评价指标的权重Wi。

2.2.2 正态云模型 云模型是定性定量不确定性人工智能转换模型，通过把概念的模糊性和随机性进行集成，进而映射成定性数据和定量数据。设U是一个精确数值表示的定量论域，C是U上的定性概念，若x∈U，且x是概念C的一次随机实现，若x～N(Ex,En'2)，En'～N(En, He2)，那么C的隶属度（μ）称x在论域U上的分布为正态云[18]。

正态云模型主要是通过期望（Ex）、熵（En）、超熵（He）3个数值来进行刻画。Ex表示数据的定性的概念；En体现定性概念的模糊度和概率；He是En的En，表示云的厚度[19]。

2.3 熵权-正态云模型法进行质量评价

采用UPLC测定不同产地蓬莪术中吉马酮、呋喃二烯、莪术醇和姜黄素的含量，通过确定等级指标与指标分区矩阵，确定各指标熵权系数与隶属度矩阵，最后得到不同产地指标的隶属度及评价结果，按照最大隶属度原则，即可得到不同指标的等级评价结果。流程图见图2。

图2 基于熵权-正态云模型评价不同产地蓬莪术质量的流程图Fig.2 Flow chart of quality evaluation of C.phaeocaulis from different habitats based on entropy weight-normal cloud model

2.4 蓬莪术质量等级评价体系的构建

前期研究显示莪术含有挥发油类和姜黄素类两大主要有效成分。在《中国药典》2020年版一部的植物油脂和提取物项下收载的莪术油中，挥发油类成分吉马酮和呋喃二烯为指纹图谱和含量测定对照品，莪术醇为鉴别项下的薄层色谱对照品[1]，姜黄素为莪术姜黄素类成分的代表药效成分，故选择吉马酮、呋喃二烯、莪术醇和姜黄素作为熵权-正态云模型评价指标具有较强的科学性和合理性。

蓬莪术为历版《中国药典》收载的莪术主要来源之一，以姜黄素（u1）、莪术醇（u2）、吉马酮（u3）和呋喃二烯（u4）这4个指标构建蓬莪术的质量评价体系，即指标集为U={u1，u2，u3，u4}，故确定的评估对象的因素论域为4层。根据蓬莪术评价指标，构建蓬莪术质量评价等级表，将不同产地的蓬莪术质量按照由高到低划分为5个等级，分别为I、II、III、IV、V级，即讨论的评价语论域为{ν1，ν2，ν3，ν4}。通过划分的质量评价等级，分别将各评价指标通过区间划分为相应的等级。在构建的评价指标体系中，具体的指标分区矩阵见表2。

表2 蓬莪术质量评价指标分区矩阵Table 2 Partition matrix of C.phaeocaulis quality evaluation index

3 结果与分析

3.1 指标信息熵权的确定

选取的蓬莪术质量的评价指标较多，但由于不同的评价指标间相互依赖，且蓬莪术质量受各指标的影响大小不同，因此需要对指标的权重进行赋值。熵权法是客观赋权法的一种，在Shannon引入信息论后，熵权法更能体现数据本身的特点。使用熵权法既能客观的计算各指标的权重，又能避免在赋值过程中的主观性所造成的误差。通过对测得的吉马酮、呋喃二烯、莪术醇和姜黄素含量值构建归一化判断矩阵，计算出不同指标的信息熵值与权重，然后对指标原始数据进行赋权计算，具有很强的客观性和较高的准确性。

信息熵权法基本思路是根据变异指标的大小来确定蓬莪术各指标的客观权重，若选取的蓬莪术的指标信息熵越小，说明该指标值的变异程度相对较大，提供的信息也就较多，在该产地蓬莪术的综合评价中所起到的作用也就越大，相应的，权重也就越大。利用MATLAB由熵权法计算蓬莪术不同评价指标的信息熵权值，可得吉马酮的信息熵权值为0.214 1，莪术醇的信息熵权值为0.328 5，呋喃二烯的信息熵权值为0.249 3，姜黄素的信息熵权值为0.213 4。

3.2 构建模糊关系矩阵

对蓬莪术质量的评价指标级U和评价语论域V之间进行评价，构建模糊矩阵（R），该矩阵中的元素Rij表示在U中第i个因素对V中第j个等级的隶属度，计算3个特征值：Ex、En、He。

假设指标i对应评价等级j的上下边界值为[Imin，Imax]，则Ex=(Imin+Imax)/2。由于边界值属于对应2个等级，即2种级别的隶属度相等，由（6）可计算出En的表达式为（7）。受评论域本身模糊概念的影响，通过实验来确定He取值的大小。根据建立的莪术质量评价体系和评价标准，各指标对应的评价等级用正态云模型来表示，具体的评价指标的正态云标准见表3。

表3 蓬莪术质量评价指标正态云特征参数矩阵Table 3 Normal cloud characteristic parameter matrix of C.phaeocaulis quality evaluation index

3.3 模糊隶属度矩阵计算

根据获取的数据，利用MATLAB编程，带入云模型的X条件云发生器，求出各个指标隶属于某等级的隶属度，最终得到隶属度矩阵，为提高数据的正确度和可信性，重复计算1000次，取其平均值为最终隶属度，关于姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯4个指标的正态云隶属度函数见图3。

图3 吉马酮 (A)、呋喃二烯 (B)、莪术醇 (C) 和姜黄素 (D) 隶属度云图Fig.3 Cloud chart of gemacrone (A), furadiene (B), curcumol (C), and curcumin (D)

假定n＝100，根据各指标值，利用正向云发生器产生的隶属度矩阵，将采集的数据带入上述等级云模型构建的正向云发生器，重复进行500次运算，得到在不同隶属度下的平均值，以四川崇州的莪术计算结果为例，结果如表4所示

表4 四川崇州产地莪术评价指标的隶属度矩阵Table 4 Membership matrix of C.phaeocaulis from Chongzhou, Sichuan Province

3.4 熵权-正态云模型法综合评价

以四川崇州所产蓬莪术为例，将表4的隶属度矩阵乘以“3.1”项熵权值，得到产地为四川崇州的蓬莪术各评价等级的隶属度，I级对应的隶属度为0.325 6，II级对应的隶属度为0.402 4，III级对应的隶属度为0.319 3，IV级对应的隶属度为0.147 8，V级对应的隶属度为0，按照最大隶属度原则，可知产地为四川崇州的蓬莪术的质量评价等级为II级。不同产地蓬莪术等级隶属度及质量评价结果是根据最大隶属度原则来进行判定，隶属度函数是模糊集合理论的基石，是度量模糊程度的函数。通过隶属函数，模糊理论能将模糊现象转变成精确数学从而进行分析和讨论。隶属度函数μA（x）是论域中所有元素属于模糊集合A的隶属度分布[14]，而模糊集合是一个有着不同隶属度的元素集合。本实验构建的熵权-正态云模型是由2次串接的正态云发生器生成的许多云滴组成的泛正态数学映射图像，是一朵可以伸缩、无确定边沿、有弹性的云图[14]，进而完成从蓬莪术的微观物质基础到等级质量之间的相互映射。

根据产地为四川崇州的评价过程，得到采样的15个产地的蓬莪术评价结果如表5所示。表5中得到的数据均是利用构建的熵权-云模型的隶属度函数计算出的对应于不同产地不同等级的隶属度值，因而不同产地同一等级的标准会出现不同的情况。通过比较某一产地在不同等级的隶属度值的大小，可以对该产地的等级进行划分，依据模糊评判的最大隶属度原则，产地中最大的隶属度值，就是该产地所对应的等级。如四川温江产蓬莪术在I级到V级对应的隶属度值分别为{0.325 6、0.227 5、0.150 7、0、0}，其中隶属度值最大为0.325 6，那么四川温江产蓬莪术的评价等级为I级。

表5 不同产地蓬莪术等级隶属度及质量评价结果Table 5 Membership degree and quality evaluation results of C.phaeocaulis from different habitats

采样的15个不同产地的蓬莪术指标等级分布均分布在第I～V级，且以第III级居多，占到了全部等级的40%，第II～IV级占全部等级的81.1%，没有出现某一产地的指标等级很高或者很低的情况。在姜黄素含量方面，四川产地的等级全部集中在第I级和第II级，广西产地全部集中在第II级和第III级，云南产地全部集中在第III级。在莪术醇含量方面，四川产地绝大部分集中在第II级，广西产地绝大部分集中在第I级，云南产地集中在第III级和第II级。在吉马酮含量方面，四川产地以第III级居多，云南产地和广西产地以第IV级居多，云南产地还出现了第V级的情况。在呋喃二烯含量方面，四川产地在第I级、第II级、第III级均有分布，以第II级居多，广西产地以第II级居多，云南产地以第III级居多，也出现了第IV级的情况。从以上分析可知，有的产地所处指标高而其他指标低，只是单纯的考虑某一种指标来评定某一产地蓬莪术质量的等级就显得相对不客观。通过熵权-正态云模型总体评价可发现，四川产地的蓬莪术总体质量评价结果较高，绝大部分分布在I、II级，其中，又以四川温江产地的蓬莪术评价结果最好，为I级。广西所产的蓬莪术以III级居多，评价结果以III级为主，制约因素为吉马酮含量。云南蓬莪术质量以III、IV级为主，主要制约因素为姜黄素和莪术醇含量。

根据“2.1”项对蓬莪术饮片中姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯4种成分的含量进行描述性统计分析，计算不同产地不同指标蓬莪术的4种成分的含量，其数据分布见表6。利用Kruskal-Wallis检验检验（P＜0.001）发现，不同产地蓬莪术饮片所含4种成分的含量具有显著性差异。姜黄素以四川产蓬莪术含量最高，莪术醇以广西产蓬莪术含量最高，吉马酮以四川和广西产蓬莪术含量相对较高，呋喃二烯以广西和四川产蓬莪术含量较高，验证了熵权-正态云模型法综合评价的科学性。

表6 不同产地蓬莪术中4种指标成分含量Table 6 Contents of four index components of C.phaeocaulis from different habitats

4 讨论

莪术为破血消癥要药，中医在临床治疗中应用莪术有着悠久的历史，含莪术药味的经典传统方剂多达上百首[20]。莪术有3个来源，分别是姜科植物蓬莪术C.phaeocaulisVal.、广西莪术C.kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang或温郁金C.wenyujinY.H.Chen et C.Ling[1]。蓬莪术的道地产区为四川，广西莪术道地产区为广西，温莪术多产于浙江一带，但随着种植范围的扩大以及经济需求的拉动，蓬莪术也被大量引种到广西、云南等地进行栽培。由于不同产地土壤、光照、水分、温度等环境因素有所差异，同一来源的莪术质量也会有差异，覃禹等[21]采用红外指纹图谱结合软独立建模聚类分析法模型识别法，建立了一种能够快速有效地鉴别不同产地的莪术的方法；顾丽亚等[22]采用HCA、PCA和正交偏最小二乘法对不同产地莪术进行质量评价；蓝振威等[23]基于GC-MS与化学计量学的挥发油成分分析，来区分不同来源的莪术。现有关于莪术质量评价研究，多选用道地产区药材来评价不同来源和不同产地莪术的质量差异，鲜有采用非道地产区的莪术进行研究。因此，对道地产区和其他主产区的蓬莪术进行研究，对不同产地蓬莪术的质量评价提供更加全面的科学依据。

现有统计模式识别，如灰色关联度主要是对相似程度的指标进行关联度分析，PCA是把相关指标重新组合成无关的一组综合指标，HCA则是依据实验数据进行分组归类，均没有考虑到实验数据质量等级划分的模糊性和随机性。熵权-正态云模型是一种模糊模式识别，以模式信息的隶属关系为依据，建立隶属度函数，计算样本的隶属度，实现对模糊子集、模糊特征和模糊关系的分析，产生分类和决策。通过传统的化学计量学分析方法，均得到了一致的结果，即15个产地的蓬莪术可根据不同产地归为3类，表明不同产地间的蓬莪术之间具有差异性。传统的模式识别（如PCA、HCA等）仅仅只是对不同产地的蓬莪术进行分组归类，而熵权-正态云模型是在传统的模式识别基础上对不同产地的蓬莪术进行了质量等级的细分，更具有优势，这些物质基础的差异很可能是导致药材质量、药效作用差异的根本原因。

本实验运用了云模型的思想构建蓬莪术质量的评价体系。以不同产地蓬莪术为对象，先测定姜黄素、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯的含量，再利用熵权法测定不同指标的信息熵，结合云模型，利用正向云发生器，将各指标等级的界限转化为云，计算不同产地的蓬莪术平均等级隶属度，得到不同产地蓬莪术质量评价结果。熵权-正态云模型评价法不仅综合考虑了影响蓬莪术质量的多个化合物含量，还采用了熵权法来计算各化合物的权重确定各指标因子对药材质量的影响大小，将定性与定量转换的云模型引入到莪术质量评价研究中，建立了基于熵权-正态云模型的蓬莪术质量评价模型。对来自于15个产地的莪术有效成分进行评价，表明四川作为蓬莪术的道地产区，具有明显的道地优势。另外，本文建立的宏观状态的数学模型与物质基础相统一的蓬莪术质量评价体系，为中药质量评价提供了一种全新的思路。

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