不同水力条件下海水人工湿地净化效果及其影响分析

贾 军 ,崔正国,唐小双,张可可 ,崔鸿武 ,李晓娇1, ,曲克明

(1 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心，上海 201306；2 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东省渔业资源与生态环境重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室,海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071)

中国是海水养殖大国，2019年海水养殖总产量为2 065.33万t，产值3 500余亿元[1]。海水养殖在带动沿海地区社会经济发展、增加渔民收入、提高人民生活水平和优化饮食结构等方面发挥了重大作用[2]。另一方面，中国海水养殖仍存在一些粗放的养殖方式，养殖尾水的任意排放给局部近岸海洋环境带来严峻挑战。因而，在生态文明和绿色新发展理念背景下，实现养殖尾水达标排放已成为水产养殖可持续发展和产业升级的必然要求。

目前，循环水处理[3]、电化学[4]、絮凝[2]等已逐渐应用于海水养殖尾水的处理。循环水处理系统自动化程度高,运行稳定,便于维护,节水节能,能够准确测量和控制水质环境因子,将养殖环境控制在最佳状态,适合大规模和高密度水产养殖，但是循环水处理设备的陈旧、老化可能产生微生物黏泥现象，影响循环水处理的质量；电化学技术是一种绿色环保发展前景广阔的水处理技术，整体工艺简单，反应装置简单易操作，反应条件温和，但电化学需要大量电极材料，而电极材料比较昂贵，经济成本高，而且单独使用电化学时无法达到预期效果；生物絮凝是解决海洋水产养殖(特别是循环水养殖)所面临的氮素污染、养殖环境制约和部分养殖方式饲料成本较高等问题的有效技术，主要适用于滤食性养殖对象，饲料的多级利用可以实现饲料成本的降低，但是碳源的成本、天气状况的影响都会给生产增加很多不稳定性。人工湿地是一种综合的水处理技术，利用物理、化学和生物等手段实现对氮、磷、化学需氧量(COD)等污染物的去除，因其净化高效、成本低廉和绿色环保等优点，已被应用于处理生活污水、工业废水和暴雨径流等不同类型水体，并取得良好去除效果[5]。目前，人工湿地技术对黄颡鱼[6]、青鱼、草鱼[7]、鳜鱼[8]、翘嘴红鲌[9]等淡水养殖尾水处理已显示出良好的应用前景。由于海水的盐度效应，将人工湿地用于处理海水养殖尾水的研究较少[10]，王艳艳等[11]利用复合垂直流芦苇人工湿地处理大菱鲆养殖尾水，发现间歇进水方式影响着人工湿地脱氮效率,调节间歇进水时间可作为调控系统脱氮效率的一种手段；吴俊泽等[12]利用复合垂直流人工湿地处理牙鲆养殖尾水外排水，发现DIN的去除效果比DON好，表层基质脲酶活性与TN和硝酸盐的去除存在相关趋势，脱氢酶活性影响着尾水中氨氮的去除。水力负荷、水力停留时间是影响人工湿地净化效果的关键水力因素。不同类型或不同处理工艺的人工湿地对污水中的污染物净化效果不同[13-14]。

本研究结合文献资料并通过预试验设置3种不同水力负荷及水力停留时间，利用复合垂直流人工湿地探讨牙鲆养殖尾水氮、磷、COD等主要污染物的净化效果及其影响因素；并利用高通量测序的方法，分析了人工湿地微生物群落结构与脱氮作用的关系，以期为海水养殖尾水人工湿地处理技术的应用提供参考，并为强化海水养殖尾水中氮的去除提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 系统构建

人工湿地尾水处理系统由牙鲆(Paralichthysolivaceous)养殖池、沉淀池、复合垂直流人工湿地系统以及储水池等组成(图1)。

图1 牙鲆养殖尾水人工湿地处理系统示意图Fig.1 Schematic diagram of constructed wetland system for P.olivaceus culture wastewater treatment

养殖池为圆柱体聚丙烯材质，直径0.6 m、高0.8 m，有效容积0.13 m3；人工湿地长0.8 m、宽0.6 m、高0.8 m，有效容积0.3 m3。人工湿地通过隔板均分为下行流池和上行流池两部分，底部相通。由下往上依次填入砾石35 cm(粒径5～15 cm)、煤渣20 cm(粒径3～10 cm)、粗砂10 cm(粒径1～5 mm)，种植互花米草(SpartinaalternifloraLoisel)，密度为60株/m2。系统一侧外置采样管，可实时采集各基质层水样，设置采样点7个，其中1、2、3分别为下行流池中进水层、粗砂层、煤渣层采样点；4为砾石层底部采样点；5、6、7分别为上行流池煤渣层、粗砂层和出水层采样点。

1.2 系统运行及水力条件控制

2019年8—10月，在山东省海阳市某水产有限公司开展养殖尾水处理试验。养殖池位于养殖车间内，人工湿地处理系统置于室外。系统各单元通过水管连接，养殖尾水自养殖池排出后，经沉淀池过滤后由泵提升至人工湿地处理系统，依次经下行流池、上行流池净化后自流进入储水池。处理后的尾水排放或回流至沉淀池进行循环处理，试验装置及流程如图1所示。每日喂食牙鲆早、晚各1次，首次投喂2 h后开始试验。试验初期先试运行，进行人工湿地系统微生物培养，定期监测进、出水水质指标，1个月后微生物群落基本形成，出水水质趋于稳定，开始水力条件对净化效果影响试验。参照实验室人工湿地前期运行参数，控制水力负荷(HLR)和水力停留时间(HRT)。首先在20 m/d水力负荷状态下，设置3组不同的水力停留时间：1.5 h、3.0 h、4.5 h。水力停留时间的长短按照循环次数进行控制，3组停留时间分别循环运行0次、1次、2次。每天定时测定水质变化，根据第5天处理效果稳定后的水质计算污染物去除率，3组停留时间下试验周期为15 d。按照水力负荷由低到高的顺序，分别在3组停留时间下运行系统，并取样分析，试验总时长45 d。试验期间记录天气变化，避免因雨水进入对处理系统造成干扰。试验运行期间系统内水质pH为7.53～8.57、溶氧(DO)0.93～5.80 mg/L、温度20.3 ℃～24.1 ℃、盐度范围31.54～33.63。

1.3 采样与测定方法

利用对角线五点取样法[16-17]分别采集植物根部和不同基质层样品，然后将植物根部和各层基质样品分别混匀，并置于无菌袋中，在4 ℃下保存运输到实验室，将植物根部置于无菌管中，加入10 mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH=8.0)，震荡洗涤，该步骤重复两次。将洗涤后的根部取出，放入装有磷酸盐缓冲液的小瓶中，超声波洗涤10 min(参数：160 W，30 s/30 s)。将3次洗涤液混合后用离心机离心收集沉淀(10 000 g离心10 min)，所有样品放于-80 ℃冰箱保存待测。

1.4 高通量测序分析方法

先用CTAB法[18]提取样品DNA，利用超微量分光光度计测定DNA的质量浓度和纯度，并在5 V/cm的电压下使用1%质量浓度的琼脂糖凝胶电泳对DNA的质量浓度和质量进行检验。

细菌的16S rRNA基因扩增的上引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3′)，下引物为806R(5′-GGCTACHVGGGTWTCCTAAT -3′)，PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环27次；最后72 ℃延伸7 min，终止温度10 ℃。每个样本重复3次。

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化，Tris-HCL洗脱，2%的琼脂糖电泳进行检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega公司)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2*300的文库。利用Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据分析

α-多样性指数(Chao指数、Shannon指数、Simpson指数、Coverage指数)可用Mothur 1.30.1软件分析得出[19-20]。Chao指数是用Chao1算法估计微生物群落中含OTU 数目的指数，常用来估计物种总数[21]；Simpson指数值越大，说明群落多样性越低；Shannon指数值越大，说明群落多样性越高[22]。

2 结果

2.1 无机氮的去除效果

不同形态DIN在不同水力负荷、停留时间条件下的净化效果见图2。

图2 不同水力条件不同形态DIN质量浓度沿程变化Fig.2 Concentration variations of and DIN under different hydraulic conditions

DIN在不同水力条件的净化效果见图2b。沿着水流方向DIN质量浓度总体呈下降趋势。在水力负荷20 m/d条件下，当HRT为1.5 h时，去除率最低为(52.48±1.44)%；当HRT为4.5 h时，去除率为(95.90±0.53)%；水力负荷在40 m/d条件下，3个HRT条件下，进水DIN质量浓度2.71～4.08 mg/L，出水质量浓度0.22～1.72 mg/L，去除率分别为(47.29±1.50)%、(57.92±2.18)%和(93.85±2.36)%。

图3 不同水力条件质量浓度沿程变化Fig.3 Concentration variations of under different hydraulic conditions

2.3 COD的去除效果

COD在不同水力负荷条件的净化效果见图4。

图4 不同水力条件COD质量浓度沿程变化Fig.4 Concentration variations of COD under different hydraulic conditions

由图4可知，沿着水流方向COD质量浓度总体呈下降趋势。水力负荷在20 m/d条件下，当HRT为4.5 h时，COD进水质量浓度(2.52±0.11)mg/L，去除率最高为(45.59±6.36)%。水力负荷在40 m/d条件下，在HRT为1.5 h、3.0 h、4.5 h时，出水质量浓度分别为(0.05±0.03)mg/L、(0.14±0.05 )mg/L、(0.01±0.01)mg/L，去除率分别为(36.25±4.95)%、(29.49±5.43)%和(38.95±4.14)%。水力负荷在100 m/d条件下，COD的去除效率明显降低，波动变化较大，3种HRT条件下的去除率分别为(28.23±3.92)%、(26.52±3.38)%和(34.06±0.66)%。

总体而言，下行池的平均去除效率为(48.12±11.46)%，要远高于上行池的(34.56±5.90)%。当水力负荷为20 m/d、HRT为4.5 h时，COD的去除效果最好。

2.4 微生物群落结构

本次试验共测序出934 000条高质量序列，经97%相似性聚类后产生5 089个OTUs。微生物测序中物种覆盖度(Coverage指数)均大于0.98，测序结果表明采集方式设置合理，测序深度覆盖样品中大部分物种。系统运行45 d后，人工湿地系统不同基质层和植物根系的α-多样性指数见表1。

由表1可知，下行池植物根系的菌群丰度高于粗砂层和煤渣层菌群丰度，高于粗砂层38.03%，高于煤渣层9.89%；上行池植物根系微生物的物种丰度略低于粗砂层和煤渣层微生物的物种丰度，下行池植物根系菌群丰度高于上行池7.85%。下行池中，各基质层Chao指数随着深度的变大呈现逐层升高的趋势，其中粗砂层为2 329.61±311.09，渣层为2 926.03±324.49，碎石层为3 220.31±365.59，粗砂层物种丰度最低，碎石层物种丰度最高，而上行池呈现相反的趋势，Chao指数随着深度的变大呈现逐层降低的趋势，粗砂层物种丰度最高，为3 043.48±329.13，碎石层物种丰度最低，为2 754.89±273.46，粗砂层物种丰度高于碎石层10.48%。

下行池中植物根系微生物Shannon指数高于各基质层微生物Shannon指数，高于煤渣层17.03%，高于粗砂层10.19%，高于碎石层2.64%；各基质层中碎石层微生物多样性最好，Shannon指数为5.69，粗砂层次之，Shannon指数为5.30，煤渣层最差，Shannon指数仅为4.99，Shannon指数跟基质层填料结构和水流状态有关，下行池的碎石层更有利于微生物的附着。上行池中，粗砂层微生物Shannon指数最高，群落多样性最高，高于煤渣层3.95%，高于碎石层8.43%，植物根系微生物群落多样性仅高于碎石层0.56%。上行池粗砂层和煤渣层微生物物种丰度、群落多样性均比下行池粗砂层和煤渣层高，上行池碎石层微生物物种丰度、群落多样性比下行池碎石层低。

养殖尾水中的氮是难以达标排放的主要污染物。通过对植物根系、基质层样品微生物功能的鉴别分析，筛选出具有脱氮功能的菌群。如表2所示，其中P1为下行池植物根系样品，S(1～3)为下行池基质样品；P2为上行植物根系样品，S(4～6)为上行池基质样品。

在复合垂直流人工湿地中微生物的脱氮方式主要有氨氧化、亚硝酸盐氧化、反硝化。在微生物菌群中，具有氨氧化功能的是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)两类菌属。具有亚硝酸盐氧化功能的是硝化螺旋菌属(Nitrospira)，进行反硝化反应的菌群主要是芽孢杆菌属(Bacillus)、铜绿假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)三类菌群。本次试验共发现15个菌属，12个反硝化菌属，2个氨氧化菌属和1个亚硝酸盐氧化菌属，其中丰度最高的是芽孢杆菌属(Bacillus)，占比0.97%，铜绿假单胞菌属(Pseudomonas)次之，丰度0.02%，本试验人工湿地中脱氮菌群以具反硝化功能的菌群为主。

3 讨论

3.1 水力负荷的影响

无机氮去除率随着水力负荷的增加而降低，低水力负荷条件下，可以满足人工湿地内各种脱氮反应顺利进行所需的时间，各种脱氮反应得以高效进行，水力负荷增大，脱氮效率降低，超过某个水力负荷条件后呈现迅速降低的趋势，高水力负荷条件下，尾水污染物沉淀和接触时间下降,植物根系吸附水体中微小颗粒效率降低[23]，不利于植物对营养物质的吸收,也不利于硝化反应和反硝化反应的完全进行。水力负荷在20 m/d条件下，进水DIN质量浓度1.93～3.25 mg/L，HRT为3.0 h和4.5 h时出水质量浓度小于0.5 mg/L，符合SC/T 9103—2007《海水养殖水排放要求》[24]一级标准。

随着水力负荷升高，出水COD质量浓度亦随之升高，去除率降低。当水力负荷较低时，尾水可以更好地与人工湿地接触，微生物的降解作用和生物膜的吸附作用比较充分，但是容易形成厌氧状态，COD去除效果不佳；增加水力负荷，水流速度变快，人工湿地内部溶氧增加，COD去除效果随之增强；随着水力负荷的进一步变大，大量的有机物还没有跟微生物群落充分接触就被带出人工湿地系统，从而影响COD的去除效果，导致COD去除率降低。本系统牙鲆养殖尾水经人工湿地处理前，仅初沉淀后COD的最高质量浓度5.75±0.09 mg/L，已符合一级标准排放要求。COD的去除主要是基质吸附与微生物降解的过程,因而有利于吸附和生化反应过程的运行条件，将有利于COD的去除率的提高。

3.2 停留时间的影响

水力停留时间较短的两个试验组中，COD质量浓度较高，特别是在上行池的上升趋势比较明显，COD去除率较低，延长HRT，去除率有明显改善。HRT明显缩短，导致与附连在基质的生物膜接触时间变短，有机物还未来得及被降解或吸附就被带出系统，污染物迁移转化进行的不够彻底，导致COD去除率下降。过长的HRT使系统更容易产生厌氧状态且受基质吸附饱和的影响，导致COD去除率有所较低，因此实际应用中需注意COD去除效果的HRT转折点。本系统牙鲆养殖尾水经人工湿地处理前，初沉淀后COD的最高质量浓度5.75±0.09 mg/L，已符合一级标准排放要求。

3.3 微生物的影响

下行池独特的布水方式使溶氧更充足，尾水最先进入下行池，植物根系能拦截大部分颗粒性悬浮物，下行池植物根系更适宜微生物的生长，因水流走向，上行池植物根系位于系统末端，此处的尾水营养物质量浓度不如下行池，微生物物种丰度和多样性不如下行池。下行池和上行池植物根部最远深扎煤渣层，两个流池煤渣层溶氧环境相近，微生物环境相近，Chao指数大小相近。上行池底部溶氧较少，处于缺氧环境，碱度也在此累积，不利于微生物的生长，上行池碎石层微生物菌群丰度比下行池略低，菌群多样性也比下行池低。

下行池中，植物根系样品中测得的具有脱氮功能的总共3 318条序列，高于基质中测得的2 691条，植物根系聚集的脱氮功能菌群均比各层基质多。植物根系径向泌氧(ROL)是构造根际氧化-还原异质微生态系统的核心要素[36]，植物根系深扎基质层，形成各个深度的氧扩散层，形成氧化态的微环境，为各类好氧、厌氧微生物提供良好的生长条件，是人工湿地中有机物、氮磷营养盐吸收转化最剧烈的部分[37]。与唐小双[38]的研究结果一致，具有亚硝酸盐氧化代谢、反硝化代谢功能的菌属聚集在植物根系，而氨氧化代谢的功能菌群则更多地分布在各基质层中，主要是因为氨氧化细菌属更适应于偏碱性环境中[39]。从pH数据可以看出，基质层中下层的pH更高，反硝化反应发生后的pH环境适宜氨氧化细菌的生长。

上行池中，植物根系测得具有脱氮功能的序列共有2 126条，而在基质中共测得3 290条序列，与下行池中脱氮功能菌群的分布情况刚好相反。尾水进入下行池先接触基质层，再流经植物根系，因此大部分异养厌氧细菌会聚集在基质层，对COD、氮磷营养盐进行吸收转化。当尾水流经植物根系时，营养物质质量浓度降低，影响植物根系微生物的生长活动。从代谢功能来看，具有氨氧化代谢、反硝化代谢功能的菌属聚集在基质层，亚硝酸盐氧化代谢的功能菌群更多地分布在植物根系。复合垂直流人工湿地系统底部处于缺氧状态，pH达到峰值，属于碱性环境，因而上行池底部不适合反硝化功能菌群生长，氨氧化功能细菌适宜pH范围比反硝化功能细菌大，能够较为良好地适应；亚硝酸盐氧化功能菌群倾向于分布在植物根系。

下行池与上行池脱氮功能菌群的分布情况由复合垂直流人工湿地pH环境、植物根系深度和水流方向等因素共同决定。

3.4 pH的影响

低水力负荷有利于人工湿地系统pH的稳定和脱氮效率的提高。不同水力负荷条件下，pH变化趋势相近，水力负荷状态对pH的改变影响较小，进入下行池后pH迅速升高，在下行池保持上升趋势，且高水力负荷条件下pH波动比低水力负荷条件略大，在碎石层达到最高值，除水力负荷为40 m/d、HRT为3.0 h外，进入上行池后均保持缓慢的变化趋势，但从不同水力负荷pH曲线变化可以看出，低水力负荷在人工湿地系统后段能保持pH平稳的下降，高水力负荷条件则会引起pH的上升。

停留时间会影响出水pH变化，进而影响人工湿地系统的脱氮效率。水力负荷在20 m/d条件下，HRT为1.5 h和3.0 h时，pH在通过煤渣层后又开始上升，或者维持很小的下降趋势，表明短时间处理下尾水中还有许多未被反硝化反应处理掉的氮营养盐，使得上行池存在的脱氮功能细菌仍旧能够进行氮营养盐的吸收转化，上行池中氮营养盐与COD的质量浓度变化可以验证。微生物活动产生的碱度补充了被消耗的部分，但由于营养物质不够，所以并没有出现pH峰值。而HRT为4.5 h时，尾水中大部分营养物质得以被消耗，进入上行池后，碱度得不到补充，反而被大量消耗，所以pH维持着下降的趋势。停留时间会影响出水pH变化。张欢欢等[40]发现，人工湿地温度和进水有机负荷对碱度有显著性影响，有待深入研究。

4 结论

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