右美托咪定对先心病患儿体外循环术后急性肾损伤的影响

尹彩星，刘 展，司海超，张新科，秦洪猛，杜守峰，李东峰，古婷婷，冯 丹，张蓉蓉，司小萌*

(1 南阳市中心医院，南阳 473000；2 三亚市中医院，三亚 572000)

先心病患儿体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)术后急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)发病率达10% ～45%[1]，主要与CPB诱发的全身炎性反应、肾小管细胞凋亡等有关[2-4]。右美托咪定是一种α2肾上腺素能受体激动剂，可降低患者CPB术后AKI的发病风险[5-7]，但具体机制尚不明确。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)家族中部分成员可通过多种途径介导机体的炎性反应。罗琳等[8]发现，右美托咪定通过抑制患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Toll样受体2(Toll like receptor 2，TLR2)和Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)的表达，从而减轻体外循环术后的炎性反应。相关研究也证实[9-10]，右美托咪定可降低患者PBMC中TLR2和TLR4的表达水平。有研究发现[11]，TLR3及其下游信号通路中的炎症介质参与了AKI的发病。鉴于目前关于右美托咪定和TLR3的相关性研究报道较少，本研究探讨了右美托咪定对先心病患儿CPB术后的肾脏保护作用，以期为临床研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年6月～2019年6月于本院行CPB手术的先心病患儿168例作为研究对象，采用随机数字表法分为对照组和观察组，每组84例。其中，男性患儿78例，女性患儿90例；年龄2～6岁，平均年龄(4.52±0.62)岁；先天性房间隔缺损40例，室间隔缺损128例。两组患儿一般资料比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性(见表1)。所有患儿监护人均知情同意并签署知情同意协议书。本研究经本院伦理委员会批准(伦理批件号：YXLL2017-0311)。

表1 两组患儿一般资料比较

(续表)

纳入标准：① 儿童先心病诊断明确，符合《儿童常见先天性心脏病介入治疗专家共识》标准[12]，在本院择期行房间隔缺损或室间隔缺损修补，麻醉学ASA分级为Ⅰ～Ⅱ级，且所有患儿均在体外循环下完成心脏根治手术。② 临床资料完整者。

排除标准：① 紫绀型先天性心脏病患者。② 术前肝肾功能异常、左室射血分数低于40%、右心衰竭、心律失常者。③ 术中开放升主动脉后心脏不能自动复跳、有严重心律失常者。④ 存在急性感染性疾病、自身免疫性疾病、贫血者。

1.2 治疗方法

所有患儿均行脉搏血氧饱和度、心率及袖带血压监测。有文献报道[13]，右美托咪定肾脏保护作用推荐剂量为0.2～0.7 μg/(kg·h)。参考前期资料，本研究右美托咪定剂量选择0.5 μg/(kg·h)。常规麻醉诱导前15 min，观察组患儿给予静脉注射盐酸右美托咪定注射液[江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090248，规格2 ml∶200 g(按右美托咪定计)]负荷剂量1 μg/(kg·h)，随后以0.5 μg/(kg·h)速度持续泵入至术后12 h；对照组仅给予静脉泵入生理盐水至术后12 h。麻醉诱导：静脉注射咪达唑仑注射液(江苏九旭药业有限公司，国药准字H20153019,规格3 ml∶15 mg)0.1～0.2 mg/kg；罗库溴铵注射液(浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H20093186，规格5 ml∶50 mg)0.6 mg/kg；枸橼酸舒芬太尼注射液(国药集团工业有限公司廊坊分公司，国药准字H20203713，规格按C22H30N2O2S计2 ml∶100 ug)1～2 μg/kg；丙泊酚乳状注射液(广东嘉博制药有限公司，国药准字H20133360,规格50 ml∶500 mg)2 mg/kg。麻醉诱导后在可视喉镜下行气管内插管机械通气，维持潮气量为8～10 ml/kg，频率20～30次/min，维持呼气末CO2分压30～35 mmHg。患儿桡动脉和右颈内静脉(超声引导下)穿刺置管，持续泵入复方电解质[2～4 ml/(kg·h)]，采用舒芬太尼1～2 μg/(kg·h)及罗库溴铵1 mg/(kg·h)进行麻醉维持，体外循环开始前吸入七氟烷(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20040771)浓度1.5%～3%、空气1 L/min和氧气1 L/min。两组术中操作：低分子量肝素钠注射液(杭州九源基因工程有限公司，国药准字H19990035，规格0.3 ml∶3000 IU)400 IU/kg静脉推注，当稳定的激活全血凝固时间 >480 s 后建立CPB，预充液为高渗羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司，国药准字H20173260,规格250 ml∶羟乙基淀粉200/0.5 15 g与氯化钠18 g)20 ml/kg滴注和乳酸林格注射液(上海长征富民金山制药有限公司，国药准字H31020947，规格500 ml)10 ml/kg滴注。转流中注意维持血液中度稀释红细胞压积0.2～0.3，术中维持食管温度26 ℃～28 ℃，灌注流量100～150 ml/(kg·min)恒流灌注，灌注压维持在50～80 mmHg。心肌保护采用组氨酸色氨酸-酮戊二酸盐液(20～40 ml/kg)，主动脉根部灌注。转流中根据血气分析结果调节电解质，恢复循环。开放升主动脉时，常规输注盐酸多巴胺注射液(广州白云山明兴制药有限公司，国药准字H44022388，规格2 ml∶20 mg)0.5～5 μg/(kg·min)，必要时加用去氧肾上腺素0.1～10 μg/(kg·min)、多巴酚丁胺2.5～10 μg/(kg·min)等血管活性药物。转流停止后，静脉注射硫酸鱼精蛋白注射液(悦康药业集团股份有限公司，国药准字H11020246，规格5 ml∶50 mg)中和肝素，鱼精蛋白与肝素之比为1∶1.2。所有患儿手术均由本院胸心外科同一治疗组的医生完成。

1.3 观察指标

记录两组患儿围手术期的整体情况，主要包括麻醉诱导至切皮时间、主动脉阻断时间、手术时间、麻醉时间、血流动力学指标[如心率、平均动脉压(mean arterial pressure，MVP)、中心静脉压(central venous pressure，CVP)]等；在术前(T0)、麻醉诱导后30 min(T1)、术后24 h(T2)、术后48 h(T3)及术后 72 h(T4)分别抽取外周静脉血3 ml于抗凝管中，用JIDI-20D离心机(广州吉迪仪器有限公司)8000 r/min 离心5 min，收集上层血清后置于-80 ℃冰箱中保存。血清肌酐水平由本院检验科采用BK-400自动生化仪(Biobase公司)进行检测。AKI参考诊断标准[14]：肾功能48 h内急剧下降，血清肌酐水平上升≥26.5 μmol/L或≥基础水平的1.5倍，或者尿量减少<0.5 ml/(kg·h)，时间超过6 h。

1.3.1流式细胞仪检测TLR3+细胞百分比

取上述相同时间点患儿外周静脉血2 ml于肝素钠抗凝管中，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC。全血中PBMC具体分离步骤为：2 ml外周静脉血加入抗凝管中，室温下加入等体积PBS吹打混匀，继续加到含有5 ml Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中，8000 r/min离心30 min后，采用移液管插入离心管中的云雾层，轻轻吸出全部云雾层于新的离心管中，再次加入2倍体积的PBS洗涤2次，5000 r/min离心10 min并弃上清，获得的PBMC细胞浓度调整至106个/ml，取500 μl并加入破膜剂孵育30 min，再加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的TLR3单抗，置于4 ℃冰箱中继续孵育30 min，PBS洗涤1次，重悬细胞，用Accuri C6流式细胞仪(BD公司)上机检测样本中TLR3+细胞百分比。

1.3.2ELISA法检测血清NF-κB、IL-1β和TNF-α表达水平

采用ELISA法检测血清炎症因子NF-κB(美国R&D公司)、IL-1β和TNF-α(上海碧云天生物技术有限公司)，实验操作步骤参考试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组患儿围手术期血流动力学比较

两组患儿在T0～T35个时间点的心率、MAP和CVP比较无统计学差异。见表2。

表2 两组患儿围手术期心率、MVP、CVP比较

2.2 两组患儿不同时间点外周静脉血PBMC中TLR3+细胞百分比

在T0和T1时间点，两组患儿外周血PBMC中TLR3+细胞百分比无统计学差异；在T2、T3和T4时间点，观察组患儿PBMC中TLR3+细胞百分比低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组患儿PBMC中TLR3+细胞百分比

2.3 两组患儿不同时间点肌酐、NF-κB、IL-1β、TNF-α表达水平比较

T3和T4时间点，观察组患儿血清肌酐水平低于对照组(P<0.05)；T2、T3和T4时间点，观察组患儿血清NF-κB水平低于对照组(P<0.05)；T3和T4时间点观察组患儿血清IL-1β和TNF-α表达水平低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组患儿肌酐、NF-κB、IL-1β和TNF-α表达水平比较

2.4 两组患儿术后AKI发生率比较

术后48 h对两组患儿AKI发生率进行评估，观察组患儿AKI发生率(5.95%)低于对照组(19.05%)，具有统计学差异(χ2=6.585，P=0.010)。

3 讨论

国内外研究证实，先心病患儿CPB术后AKI发生率在10% ～45%[1,15]，其中死亡患儿比例达15.25%[15]，且术后合并AKI严重影响了患儿的临床预后。因此，尽快明确AKI发病机制尤为重要。尽管有文献报道[15-16]患儿CPB术后发生AKI可能与多种诱因(如血糖水平、年龄、体外循环时间、主动脉阻断时间等)有关，但术后全身炎性反应在AKI的发病机制中扮演了重要作用[2-3]。Abdallah等[17]发现白介素18(interleukin-18，IL-18)水平较高是术后AKI发病的重要预测因子，且与致死率相关；Jacob等[18]开展的前瞻性研究发现，采用高剂量地塞米松抗炎预处理后可显著降低AKI的发生风险，同时心脏手术中应用白细胞过滤器能缓解患者术后肾功能的恶化[19]。上述结果均提示炎性反应在AKI发病中发挥了重要作用。目前，多数研究仅探讨右美托咪定对TLR2和TLR4表达水平的影响[8-10]，然而其与TLR3的相关性研究报道较少。另一方面，TLR3/NF-κB信号通路在AKI发病机制中作用显著[11]，且右美托咪定具有肾脏保护作用。因此，本研究系统分析了右美托咪定干预对CPB患儿PBMC中TLR3表达及其下游信号NF-κB、TNF-α及IL-1β水平的影响。

本研究结果表明，右美托咪定可降低CPB术后患儿PBMC中TLR3+细胞百分比，TLR3与含TIR结构域的衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)结合后，通过肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)N端的结合域诱导NF-κB的激活[20]，而NF-κB可通过多种途径介导机体的炎性反应，其中最为常见的是其下游的炎症因子IL-1β和TNF-α的表达[21]。李霁等[22]发现，百草枯中毒诱导的AKI大鼠肾组织中，NF-κB和TNF-α蛋白表达水平升高；丁仁彧等[23]也证实，脂多糖诱导的AKI小鼠模型的血清和肾脏组织中IL-1β和TNF-α表达水平升高。本研究发现，观察组患儿在术后 24 h 开始，血清NF-κB水平低于对照组，但血清 IL-1β 和TNF-α表达水平与对照组相比无统计学差异；在术后48和72 h时间点，血清IL-1β和TNF-α表达水平低于对照组。另一方面，Fas相关死亡结构域在NF-κB的介导下进一步活化Caspase信号通路，从而诱导细胞的大量凋亡。Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的主要蛋白[24]。国内外研究[23，25]均证实，AKI动物模型的肾脏组织中Caspase-3蛋白和Caspase-3 mRNA表达水平较高；Li等[26]研究发现，右美托咪定可降低肺组织中Caspase-3蛋白的表达，且呈现剂量依赖性。因此，本研究提出右美托咪定预处理对CPB患儿术后肾损伤的保护作用可能与降低Caspase-3蛋白表达水平有关。

术后48 h观察组患儿AKI发生率低于对照组，说明右美托咪定对CPB患儿肾脏具有保护作用；检测肌酐水平发现，术后24 h两组肌酐水平相比无统计学差异，而在48 h观察组患儿肌酐水平低于对照组，这可能是肾脏受损后血清肌酐水平变化不敏感所致。因此，其他研究也提出采用其他分子标志物[如血或尿中IL-18、尿液中肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)及中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)]等预测AKI的发生风险[27]。

综上所述，本研究参考前期文献报道将右美托咪定干预剂量设置为0.5 μg/(kg·h)，发现其对CPB术后肾脏具有保护作用，推测其主要与抑制TLR3/NF-κB信号通路及其下游的炎症因子有关。本研究有一定局限性，右美托咪定对CPB术后肾脏保护作用与其他浓度的关系还需进一步研究。此外，本研究未对患儿PBMC和肾脏组织中的相关蛋白(如NF-κB、IL-1β、TNF-α等)进行检测；右美托咪定对CPB术后肾脏保护作用的其他机制也将是我们下一步探讨的方向。