自噬及自噬调节剂在脑缺血中的研究进展

王恺迪，张丽梅，黎 晓

（1. 赣南医学院2019级硕士研究生；2. 赣南医学院2018级硕士研究生；3. 赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000）

脑缺血（Cerebral ischemia）的病理过程十分复杂。当脑供血不足时可引发缺血缺氧，使脑实质发生广泛弥散性病变，并最终导致脑的整合机能明显受损，甚至急性死亡，因而给患者及社会带来了严重危害。然而，脑缺血的发病机制复杂多样，现有保守治疗多以溶栓药物及神经功能保护剂为主，由于受治疗时间窗（3～4.5 h）的限制［1］，导致临床治疗效果差强人意。因此，探明脑缺血发病机制以寻找新的脑缺血防治策略意义非凡。

自噬（Autophagy）是广泛存在于真核细胞中的生命现象。在正常生理状态下，自噬的发生可调节细胞内稳态；而在疾病情况下，可能引起自噬水平的变化，而对机体产生防御或损伤的双向作用［2］。大量证据表明，自噬参与了脑缺血的发生发展，但真正扮演的角色却未达成共识。现有研究结果表明，自噬的激活在脑缺血损伤中是有益还是有害，很大程度上取决于自噬靶向细胞内底物的负荷能力与细胞自噬能力之间的平衡［3］，而能够调节这种平衡状态的各类自噬调节剂也随即应运而生。为此，本文拟对自噬及自噬调节剂在脑缺血疾病研究过程中的研究现状作一归纳总结，旨在为相关研究工作者提供参考。

1 自噬概述

自噬是细胞中的一种基本分解代谢过程：当细胞处于营养饥饿或代谢应激时，自噬将被激活，继而降解受损的细胞器或功能失调的蛋白质以获得能量或游离氨基酸，实现维持组织内稳态的作用。自噬主要包括3种类型：微自噬，分子伴侣介导的自噬和大自噬，通常所说的自噬指大自噬。在真核生物中，自噬过程主要包括3个阶段：降解的细胞质成分被吞噬在双层膜中形成自噬小体、自噬小体与溶酶体（或植物和酵母细胞中的液泡）融合、水解酶催化降解其内容物［4］。越来越多的证据表明，自噬可通过选择性降解受损的线粒体、聚集蛋白、过量的过氧化物酶体和入侵的病原体而维持细胞内的稳态［5］。

2 自噬与脑缺血的关系

众多研究表明，自噬与脑缺血的发生发展密切相关。NITATORI 等［6］于1995 年首次报道了脑缺血后存在自噬现象，他们用电子显微镜观察缺血后3天的沙鼠大脑海马CA1 区发现，其中含有膜结构和部分细胞质的膜结合液泡；随后SOLENSKI 等［7］也发现，在大脑中动脉阻塞（Middle cerebral artery oc-clusion，MCAO）大鼠的脑组织中，大脑皮层神经元线粒体以凝结、基质密度增加和双膜自噬的形式表现出明显的损伤迹象，而这些结果后来均得到了证实［8-10］；并且，在缺血脑组织的胶质细胞和脑内皮细胞中也观察到了自噬现象［11-12］，这些证据表明，自噬参与了脑缺血的病理生理改变，但其作用不甚明了。

目前的证据表明，自噬对脑缺血损伤后神经元的存活起着“双刃剑”作用［13］。一些观点认为，多种神经保护机制与神经元自噬强度的增加有关。例如，缺血预处理和缺氧预处理诱导的内源性神经保护机制［14-15］，以及神经保护药物激活的神经保护［16］，均被认为激活了神经元的自噬。另一些研究则相反，他们在体外和体内的研究发现，过度的细胞自噬反而会导致神经元死亡（自噬性细胞死亡）［17-18］。这说明自噬在脑缺血中的作用可能取决于其发生程度。换言之，适度的自噬可以发挥神经保护作用，但如果自噬被过度激活，则可能促进神经细胞凋亡和神经元死亡。因此，控制自噬激活的程度似乎是研究的关键。

当前，对于基因、蛋白质及信号通路中相关分子表达水平的检测技术已日益完善，这为实现自噬过程的操纵——即自噬调节提供了技术保障。在对脑缺血疾病的研究中已成功鉴定了许多与自噬有关的基因和蛋白质［19］，因而通过调节自噬干预脑缺血疾病似乎也成为可能。甚至，在一些脑缺血干预治疗的研究中，通过对自噬的调节已显示出乐观的结果，这也激发了许多制药工业对自噬调节剂的研究和开发，因而自噬调节剂在脑缺血中的作用也成为了新的关注点。

3 自噬调节剂在脑缺血中的作用及作用机制

自噬受复杂的信号网络调控［20］。在脑缺血损伤中，通常认为自噬主要由上游调节因子即雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of target of rapamy-cin，mTOR）复合物1（mTORC1）和AMP 激活的蛋白激酶［Adenosine 5"-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］共同调节，它们接受来自压力传感器的激活或抑制的信号［21］并作出相应的反应。在营养充足的条件下，mTORC1被过度激活，而AMPK 的活性则受到抑制，在这种情况下，由于mTORC1 使ULK1 和Atg13 的磷酸化失活，两种激酶的下游靶标ULK1 激酶复合物将被抑制，进而导致自噬通量的减少［22］；相反，在营养耗尽的条件下，AMPK 可被激活，激活后可进一步使mTORC1 失活间接或直接激活ULK1 激酶复合物［23］，从而促使自噬加强。相应地，自噬调节剂在脑缺血中的作用也主要通过调控这些信号分子实现。

3.1 经PI3K 信号分子介导神经保护作用的自噬调节剂目前，经PI3K信号分子介导神经保护作用的自噬调节剂研究相对较多，通常以Ⅰ类和Ⅲ类多见。其中，Ⅲ类PI3Ks能被各种刺激如氨基酸、葡萄糖和其他营养物质激活，激活后能将磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）磷酸化为磷脂酰肌醇3-磷酸（Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），并在自噬、吞噬和胞内体运输中发挥重要作用。激活的Ⅲ类PI3K 能与自噬标记性蛋白Beclin-1 形成复合物，这有助于自噬体膜的形成，说明调节Ⅲ类PI3K的活性可以调控自噬的强度。经典的自噬抑制剂3-MA、Wortmannin 和LY294002，都是通过抑制Ⅲ类PI3K进而抑制自噬作用的［24］。此外，Ⅰ类PI3K也具有保护神经元免受脑缺血损伤的治疗价值，它在G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）或受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK）激活时被招募，一旦被招募到质膜上，它们将磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化为磷脂酰肌醇（3，4，5）P3（PIP3），PIP3是第二信使，负责激活多种AKT/蛋白激酶B 依赖性和AKT 非依赖性下游信号通路。Ⅰ类PI3K 可通过激活Akt-mTOR 途径抑制自噬，最终实现对脑缺血后神经元的保护作用［25］。自噬抑制剂HSYA 即通过激活Ⅰ类PI3K，进而抑制经AktmTOR 信号通路的自噬，从而对体外氧糖剥夺/再灌注（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤的神经元起治疗作用［26］。

很多经典的药物已被发现是通过PI3K/Akt 途径抑制过度自噬发挥对脑缺血中的保护作用。①褪黑素是一种天然神经保护剂，它通过阻止Beclin-1的表达抑制自噬并激活PI3K/Akt 途径来预防脑缺血损伤［27］；而N-乙酰血清素是褪黑素的直接前体，目前在脑缺血小鼠模型中研究发现其可通过抑制线粒体和自噬细胞死亡途径而具有神经保护作用［28］。②黄芩素（5，6，7-三羟基黄酮）乃自黄芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）根中提取的生物活性成分。YANG S 等［29］研究了黄芩素在MCAO 诱导的大鼠脑缺血再灌注亚急性期中的治疗作用，他们发现，黄芩素可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，促进PI3K/Akt-mTOR 信号通路的磷酸化，提示黄芩素可能通过抑制自噬发挥对脑缺血再灌注损伤大鼠的防治作用。③加巴喷丁（Gabapentin，GBP）是一种辅助抗癫痫药和止偏头痛的预防药物。YAN B C等［30］对其研究发现，不同剂量的GBP 预处理可激活PI3K/Akt-mTOR 通路，继而减轻因脑缺血再灌注引起的神经元损伤。④枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞的主要活性成分，已经证实其具有多种有益作用，包括神经保护，抗衰老和抗氧化等。有研究发现，LBP预处理可提高OGD/R后原代培养海马神经元中p-Akt和p-mTOR 水平，说明LBP 可激活Akt-mTOR 信号通路抑制自噬继而减轻海马神经元的损伤［31］。⑤人参皂甙是人参的主要活性成分，能够发挥调节多种神经功能的药理作用。LUO T 等［32］研究发现，人参皂甙Rb1（GRb1）对OGD 或短暂性全脑缺血模型中诱导的神经元损伤具有较好的治疗作用，其机制可能与激活PI3K/Akt-mTOR途径抑制过度的自噬有关。

以上证据表明，自噬抑制剂可通过PI3K信号分子介导神经保护作用，且种类繁多，其中还不乏多种中药的有效成分，这为进一步开发我国传统中药的药用价值具有重要参考意义。

3.2 经AMPK-mTOR 信号介导神经保护作用的自噬调节剂文献表明，一些自噬调节剂可以通过上调AMPK 信号分子诱导自噬而发挥脑保护作用。例如，白藜芦醇预处理后可以上调缺血皮质区脑组织LC3（Microtubulesas sociated protein light chain 3，MAP-LC3）和beclin1 的表达，他们认为，其保护机制可能通过上调AMPK 诱导自噬，继而减少短暂性全脑缺血大鼠皮层活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、脂质过氧化和一氧化氮（NO）等物质的产生，从而减少神经元的死亡［33］；也有研究表明，在大鼠脊髓损伤模型中，辛伐他汀的神经保护作用可能部分归因于其激活AMPK 并抑制Akt 及其下游靶标mTOR 而诱导自噬反应［34］。此外，AO L 等［35］研究发现，新合成化合物JLX-001 可减轻脑缺血损伤的潜在机制也可能激活AMPK 抑制mTOR 活性，从而诱导自噬有关。

相反地，一些自噬调节剂则被认为是通过抑制AMPK 进而抑制自噬发挥脑保护作用的。例如，WANG J F等［36］在大鼠MCAO模型研究中发现，葛根素可以通过下调缺血侧海马中AMPK，并上调p-mTOR和pS757-ULK1 的蛋白表达水平，进而抑制自噬，发挥对脑缺血/再灌注损伤的保护作用；另一项研究称，五味子素也可通过调节AMPK-mTOR 途径抑制自噬，对OGD 模型中的PC12 细胞起保护作用［37］。由此，通过AMPK 直接或间接介导神经保护作用的有关自噬调节剂的研究仍处于初级阶段，且该类自噬调节剂的具体作用靶点仍不清楚，尚需更多的研究进行探讨。

3.3 经MAPK 信号介导神经保护作用的自噬调节剂丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通常分为ERK、p38、JNK 和ERK5 四个亚类。许多对中药神经保护机制的研究发现，其作用可能通过MAPK信号通路介导自噬发挥的。例如，吴茱萸碱可以通过JNK 信号通路激活自噬来改善脑缺血［38］；黄连解毒汤可以通过MAPK 信号通路抑制mTOR进而激活自噬，从而减轻脑缺血损伤［39］。

最近经FDA 批准的神经保护性自噬调节剂bexarotene，是维甲酸X 受体激动剂。在脑缺血合并黄斑病变的老年共发病模型中，bexarotene可增加自噬标记物LC3-II 和p62 的表达，同时可以减轻线粒体的损伤，而神经元的损伤很大程度上取决于线粒体损伤，说明bexarotene 可以通过激活自噬维持线粒体的稳态，使神经元免受损伤；同时在患有中风和脊椎病的小鼠模型中，研究者应用bexarotene后可增强其脑部自噬标记物LC3-Ⅱ和p62 的表达，脑缺血引起的梗死显著减少，且行为缺陷也得到改善，并认为该作用可能通过JNK 途径实现，这就验证了bexarotene 可能通过MAPK 信号分子介导其神经保护作用［40］。如此看来，经MAPK 信号分子介导的自噬调节剂多以激活自噬的形式发挥神经保护作用的，而其具体的激活机制仍需进一步阐明。

3.4 其他自噬调节剂事实上，还有很多药物虽已证实在脑缺血中发挥神经保护作用的同时也改变了自噬的强度，但其具体的作用路径却并未明确。比如，醒脑静和犀牛地黄汤等中药复方在发挥对神经细胞的保护作用的同时，能降低Beclin1 和LC3 的表达，即减弱脑缺血大鼠的自噬程度［41-42］；再比如米诺环素作为广谱四环素类抗生素，也被发现可以显著降低大鼠TUNEL 阳性细胞和Beclin-1，LC3-II/LC3-I的比值和caspase-3/8的蛋白水平，即可以通过减少大鼠模型中细胞凋亡和自噬的激活来对抗脑出血［43］；同时，我们的研究也发现，对植物雌激素——染料木素（Genistein）进行磺酸化结构改造后所得的染料木素磺酸钠（Genistein sodium sulfo-nate，GSS）对缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护作用也可能与抑制自噬有关，但其具体的作用机制还有待进一步研究［44］。总之，这类自噬调节剂的作用路径甚为复杂，可能通过上述一条或多条通路，甚至通过其它新的未知路径实现其对缺血性脑病的治疗作用。

4 小结与展望

迄今认为，自噬在脑缺血损伤过程中是一把“双刃剑”，因而对自噬程度的调节或许可成为治疗脑缺血的一个方向。由于自噬是一个由多分子靶点组成的复杂过程，又受到多种信号通路控制，因此，对自噬调节剂的选用也需全面而审慎。另外，许多自噬调节剂及自噬级联反应过程都得到了很好的研究，但同时针对自噬级联反应中相同途径或关键自噬蛋白的负性或正性调节剂的研究却不多见。并且，同一种调节剂对自噬的调节产生不同结果的机制也不甚明了，目前认为这可能与脑缺血的自噬程度有关，如SHI 等［45］发现在氧-糖剥夺模型中发现再灌注前24 h，3-MA 会导致大量的神经细胞死亡；而在48～72 h，3-MA 又会表现为显著的神经元保护作用，同一种调节剂在同一模型中发挥着完全不同的作用，这也许是由于长时间的氧-糖剥夺导致的自噬被过度激活所致。值得注意的是，同一种自噬调节剂在脑缺血中的不一致结果也可能因不同的实验过程中所给的剂量及途径不同，或这些调节剂本身并不是单一特异性，再者有可能因实验过程中不同的动物模型带来的差异等，诸多因素影响了结果的呈现。

所以，自噬过程的复杂性及脑缺血过程中脑功能变化的复杂性，均导致了自噬的研究在不同的实验中无法显示出一致的稳定结果，这给自噬在脑缺血的研究也造成了一定的困难。同时，不同程度的自噬对神经功能作用的对立结果仍值得我们深思，在今后对脑缺血的干预研究中，对于自噬调节剂的选用或是研究开发，应有更审慎的态度。我们也期待，在以后的研究中可以确定自噬在神经保护功能与损害功能之间的中立点，对自噬调节剂加以正确利用，这将为临床治疗脑缺血提供新的策略。