白藜芦醇对小鼠血小板氧化应激和衰老指标及储存时间的影响*

贾彦军 赵续影 魏珍珍

血小板是一种寿命较短（7～10天）的无细胞核循环碎片，用于临床输血的血小板需在（22±2）℃振动储存[1]。由于血小板含有功能完整的细胞成分，包括溶酶体、线粒体和致密颗粒，因此血小板同样具有生物活性现象，如程序性细胞死亡（凋亡）、线粒体自噬和细胞衰老[2]，这些生物进程可能是造成血小板储存损伤（platelet storage lesion，PSL）的主要原因。PSL是导致血小板结构和功能逐渐损伤的所有有害变化的总和，其具体发生机制目前仍不明确，而氧化应激被认为在PSL中起到重要作用[3]。目前，抑制血小板代谢及活化已成为减轻PSL并延长储存时间的主要策略，白藜芦醇（3,40,5-三羟基异苯乙烯）作为一种天然的多酚化合物，广泛存在于果皮、花生及红酒中，具有显著抗氧化作用，且几乎没有毒性，已有研究[4,5]显示其具有延长细胞寿命的作用，但对于血小板氧化应激、衰老及储存时间的影响尚无相关报道。

材料与方法

1 取材与处理 选取6周大小的C57 black 6品系小鼠5只，取全血并使用ACD（柠檬酸钠85.0 mmol/L，柠檬酸71.4 mmol/L，葡萄糖111.1 mmol/L）抗凝，ACD与全血体积比例为1∶6；于25℃下200 g离心10 min得到富含血小板的血浆，将每只小鼠样本平均分为观察组与对照组，观察组中加入白藜芦醇（购自中国药品生物制品检定所），并使用二甲基亚砜（购于上海顺强生物科技有限公司）标定至50 μmol/L；对照组加入等量二甲基亚砜。

2 评价指标 所有样本均储存于（22±2）℃的振荡条件下，分别于储存第1，2，3，4，5，6，7 d进行取样检测，取样前使用37℃台式液进行温和复苏，并于3 h内完成测定，具体操作委托天津诺禾生物公司进行。

2.1 血小板代谢指标：使用血细胞分析仪（型号：COULTER-JT，美国库尔特公司）检测平均血小板体积（mean platelet volume，MPV）及血小板计数，使用pH分析仪（型号：TP310，北京时代新维公司）及葡萄糖检测试剂盒（购自北京雷根生物技术有限公司）检测两组样本不同时间（1，2，3，4，5，6，7 d）的pH值及葡萄糖水平。

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理，计数资料以百分数（%）表示，采用x2检验；计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 两组血小板分散情况对比 储存第1天两组的血小板分散和聚集水平不存在统计学差异（P＞0.05），观察组于第3天和第5天的血小板分散和聚集水平显著高于对照组（t=3.096，3.396，P=0.015，0.007；t=2.701，3.604，P=0.037，0.004），见图4、图5。

2.3 衰老指标：使用Senescence-associatedβgalactosidase（SA-β-gal）细胞染色设备及染色剂（Beyotime生物技术），用PBS洗涤样本一遍，加入1 mL 染色固定液，固定15 min。吸去固定液，加入PBS，室温放置3 min，重复3次。吸出PBS，加入 1 mL染色混合液（每1 mL染色混合液中含有930 μL染色液C，10 μL染色液B，10 μL染色液A，50 μL X-gal溶液），在5%CO2孵化器中37℃孵育1 h。使用流式细胞仪（BD FACSCanto Ⅱ）统计两组不同时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）的SA-β-gal染色阳性细胞比例。

2.4 血小板分散和聚集水平：储存前，将富血小板血浆用溶媒（对照组）或10 μmol/L白藜芦醇（观察组）处理，并在室温（22℃）下搅拌保存5天。①分散水平：于储存第1、3和5 d，洗涤血小板后在纤维蛋白原包被的盖玻片上铺展45 min。使用显微镜（Olympus BX51,100X）和图像捕获软件SPOT进行观察和计数，手动计数5个样本的4个视野，计算每个视野中完全散布的血小板百分比，并取其均值。②聚集水平采用血浆比浊法：将富血小板血浆置入无菌玻璃比色皿，加入ADP后，再加入表面涂硅的小磁粒，以1 200 r/min进行搅拌，使用全血发光血小板聚集系统（Chrono-log）自动进行测定、记录、描绘，比较两组不同时间的最大聚集率。

2.5 储存指标：测定血小板表面蛋白CD62P、膜联蛋白Ⅴ及MitoSpy阳性水平，相应试剂购自Abcam公司。不同时间（1，2，3，4，5，6，7 d）取两组血小板重悬溶液200 μL，3 000 r/min离心15 min后弃掉上清。每个离心管加100 μL 的1% BSA溶液重悬。分别加入5 μL的CD62P、膜联蛋白Ⅴ及MitoSpy抗体，加入10 μg/mL的抗GPIbα抗体，4℃避光孵育30 min。上下颠倒混匀后再加入1 mL PBS，3 000 r/min离心15 min，去上清，并用PBS溶液洗涤2次。按说明书加入相对应的荧光标记的二抗，4℃避光放置30 min，颠倒混匀。3 000 r/min离心15 min后去上清，以300 μL PBS溶液重悬后使用流式细胞仪进行检测。

本文利用RUMiC2008和RUMiC2009城镇居民收入调查数据，首次运用面板数据的分位数回归方法考察个体之间的幸福感差异及各因素对主观幸福感的影响程度，发现在控制了不随时间改变且不易观察的个体性格或心理因素等差异后，健康、疾病、婚姻状况、受教育年限、就业、年龄、性别及收入对主观幸福感的影响同大多数研究文献结论一致，即身体健康(主观和客观两个角度)、已婚、教育、高收入均可显著提高个体主观幸福感，年龄对主观幸福感的影响呈“U”形等。但主观幸福感较高的人群受这些因素影响的程度相对较小，特别是收入，其对主观幸福感的影响存在显著异质性，体现了分位数回归相对于一般回归方法的必要性。

去年11月二十国集团峰会期间，法国总统萨科齐在和奥巴马的一次私下交谈中谈到了以色列总理内塔尼亚胡。萨科齐说：“我不想再见他了，他是个骗子。”奥巴马回应道：“你也许对他感到反胃，但与你相比，我不得不更经常与他打交道。”

3 两组衰老指标对比 储存第1天两组SA-β-gal活性强度无明显差异，第2、3、4、5、6、7天观察组SA-β-gal活性强度显著低于对照组（t=3.237，4.004，4.909，3.875，4.392，3.359；P=0.013，0.001，0.000，0.002，0.000，0.010），见图3。