细菌Ⅳ型分泌系统的研究进展*

于雪荞 沈瀚 曹小利

细菌通过分泌通路实现蛋白质跨胞浆膜转运的系统，称为分泌系统[1]。细菌的分泌系统是蛋白质跨膜转运系统的一个组成部分，分泌系统的蛋白质或类蛋白毒力因子与细菌存活、繁殖等密切相关[1]。目前发现的分泌系统有Ⅰ～Ⅶ型分泌系统（见表1）。其中，Ⅰ型分泌系统是将细菌的分泌性蛋白由不同蛋白亚单位组成跨膜通道直接从胞浆送至胞外，只进行一步分泌，大肠埃希菌溶血素分泌系统属于此型[2]；Ⅱ型分泌系统主要分泌某些细菌外毒素和水解酶，先将前效应蛋白透过内膜送至周浆间隙，经过加工后再穿过外膜分泌到细胞外，Ⅳ型分泌系统是在此基础上进化而来[3]；Ⅲ型分泌系统与Ⅰ型分泌系统相似，但Ⅲ型分泌系统的分泌机制要比Ⅰ型分泌系统复杂很多；Ⅳ型分泌系统和其余几种分泌系统大不相同，广泛存在于革兰阳性菌和革兰阴性菌中，还在无细胞壁细菌和一些古细菌中被发现，且Ⅳ型分泌系统可分泌的物质范围很广，包括单个蛋白质、蛋白质复合物和DNA，其有致病岛编码的针形结构，类似菌毛[4]；Ⅴ型分泌系统是最简单且不需要ATP的分泌系统，由IcmF和DotU组成[5]；Ⅶ型分泌系统主要存在于大部分放线菌和革兰阳性菌中[6]。本文主要介绍的是Ⅳ型分泌系统。

1 Ⅳ型分泌系统的作用及分布 Ⅳ型分泌系统（T4SS）是一种在革兰阴性菌和阳性菌中均广泛存在的多功能、多组分的跨膜通道结构。该系统既能通过蛋白质又能通过DNA，因此能够介导细菌接合转移、DNA释放和摄取以及效应蛋白分泌等功能[12]。其中，T4SS所介导的接合转移是基因水平转移的重要机制之一，多数接合型质粒和整合性接合元件都依靠它们自身编码的T4SS进行接合转移，进而散播它们所携带的生物学性状，如耐药性和致病性等。目前已知T4SS在大肠埃希菌、伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、军团菌、奈瑟菌、霍乱弧菌等革兰阴性杆菌中的作用已被证实，不仅参与细菌的黏附过程，而且在细菌的免疫逃逸、表面运动、微克隆形成、转化和抗菌转换、介导与真核细胞的信号联系、凋亡和补体抑制等方面起作用[7，13，14]。

2 Ⅳ型分泌系统的分类 首先，T4SS是以质粒F、质粒RP4和质粒R64为基础，故而分为F、P、I三类[15]。再者，根据其功能，T4SS可分为三类，第一类为接合，是指通过细胞间的接触将DNA在一些G-和G+或者一些古细菌之间进行转移，从而实现细菌毒力因子的结合及抗生素抗性的转移；第二类为DNA的摄取、转化和释放功能，如幽门螺旋杆菌的ComB系统以及淋球菌的GGI遗传岛，不同的是前者作用为DNA的摄取，而后者作用为DNA的释放；第三类为蛋白质复合物等大分子的转移功能，这一类主要存在于致病菌，在细菌毒力中有举足轻重的作用[16]。其次，根据同源性，T4SS分为两类：IVA和IVB，IVA是T4AA中典型的VirB/D4系统，IVB主要是嗜肺军团菌的Icm/Dot。

3 Ⅳ型分泌系统的结构 T4SS的典型结构是VirB/D4系统，按蛋白所在的位置分为三部分：内膜内，内外膜之间即肽聚糖和外周质间隙中，以及外膜外。VirB/D4系统中起作用的是VirB操纵子和VirD4操纵子。VirD包括VirD1～VirD5五种，其中，VirD1和VirD2主要作用于T-DNA,对DNA进行转移和复制；VirD3和VirD5针对于非必须处理的蛋白，通过VirD4使其转化为连接蛋白CP；VirD4是同源多聚体整体膜复合物，主要作用是跨膜转移底物，VirD4和VirB具有协同作用[4，17]。VirB直接介导组装菌毛[17]，有VirB1～VirB11十一种，主要作用是产生成熟促进因子（Maturation-Promoting Factor，MPF）,与VirD4发挥协同作用；其中，VirB1还可以与亚菌毛单位发生相互作用，从而促进菌毛形成；VirB2、VirB5和VirB7的主要功能是实行T菌毛的组装，介导外界物质交换，VirB2是主要菌毛成分，在物质交换中发挥主要作用，VirB5是次要菌毛成分，主要功能是“收集”需要交换的物质[18]；VirB4和VirB11是VirB/D4系统能量的主要合成成分；VirB6主要起翻译功能，相关研究表明VirB6对VirB5和VirB3的稳定起调节作用[19]；VirB10是T4SS跨膜结构的支架，与VirB7、VirB8和VirB9形成复合通道，连接内膜内环境与外膜外环境，是该T4SS的结构基础；其中，VirB7和VirB9形成以二硫键链接的异二聚体，与VirB6相互作用，形成内膜和外膜之间的通道；VirB10则是与CP蛋白的N段末端相互作用而发挥功能；相关报道提出，VirB8、VirB9和VirB10会在细胞周围形成病灶[20]，因此对VirB蛋白的致病机制还有待进一步探究。有研究表示，VirB10仅存在于G-细菌内，在G+细菌和古细菌中尚未发现[21]；VirB1和VirB11共同作用产生的蛋白MPF形成通道，在G-菌中借助菌毛附着于靶细胞表面[22]，而在G+菌中是以表面黏附素附着于靶细胞表面[23]。

4 Ⅳ型分泌系统的影响 T4SS介导的遗传物质水平转移，是细菌谱系之间横向联系所必须的，不仅有助于细菌进化，也有利于耐药和毒力基因在细菌之间播散，导致耐药菌的快速发展，甚至引起院内感染暴发流行[20]；此外，细菌能够利用T4SS分泌大分子蛋白质效应物或蛋白质-DNA复合物促进它们在真核宿主内的繁殖和存活，为细菌生存提供有利环境，为发生感染提供条件；T4SS也会编码/合成一些酶，如松弛酶和引发酶，引起DNA和蛋白质的吸收、融入及对外释放，导致感染的持续发展[4]；此外，T4SS也是多种细菌的重要毒力因子，导致的典型感染包括百日咳杆菌引起的百日咳，布鲁菌引起的布鲁菌病，嗜肺军团菌引起的军团菌肺炎，贝氏柯克斯体引起的Q热，幽门螺旋杆菌引起的消化性溃疡和胃癌[10，15-22]。

5 Ⅳ型分泌系统在细菌中的应用 总而言之，T4SS是一个蛋白质和DNA转运系统，具体可分为接合、DNA的摄取释放、效应器的转移以及其它特殊功能，对细菌的毒力、耐药性、环境适应性等起举足轻重的作用。然而，在不同的细菌中，T4SS也会有所不同（见表2）。

5.1 布鲁菌：T4SS是布鲁菌重要的毒力因子之一，对布鲁菌在宿主细胞内的生存、繁殖起重要作用。研究发现，该菌的T4SS由12个VirB蛋白组成，其中，VirB1、VirB7和VirB12起增强作用[28]；VirB2和VirB5是T4SS的最外层蛋白，负责降解肽聚糖，穿透宿主细胞壁，使其进入到宿主细胞内；VirB6是内膜蛋白，主要起组装和稳定作用；VirB8、VirB9和VirB10相互联系，是T4SS的主要功能蛋白；而VirB12是一种免疫原性蛋白[12，28]。此外，大约有25%缺失VirB基因的菌株毒力变弱，可见其对细菌的致病性也有所影响[29]。

5.2 幽门螺旋杆菌：在幽门螺旋杆菌中，T4SS由Cag致病岛编码，至少由17个蛋白组成，结构机制与VirB系统相似[30]。在Cag致病岛中，CagA起核心作用，CagI、CagL和CagY对CagA起辅助呈递作用，将所需传递的底物等跨宿主细胞膜传递给CagA，由其来完成注射过程；CagA也是幽门螺旋杆菌的细胞毒素相关基因，其CagA蛋白PAI是经典的毒力因子之一[26]。此外，在该菌中还有一种ComB型T4SS系统，主要是特异性吸收DNA并将其跨外膜运输，将其呈递给ComEC系统，从而进入细胞质中。这种机制可以使细菌快速获得耐药性并适应所处环境，对细菌的生存起重要作用[31]。

5.3 淋病奈瑟菌：在淋病奈瑟菌中，T4SS是GGI遗传毒力岛，存在于大多数淋病奈瑟菌中，主要功能是DNA转化系统，大多数G-细菌对DNA的吸收依靠的是Ⅳ型菌毛（Tfp）。研究表示，当供体和受体一起培养时，供体细菌会发生自溶为受体细菌提供DNA，自溶的程度可能与AtlA的存在有关[32]；Tra-F是DNA释放系统，ComP可增强ComP和PilT的表达，从而增强Tfp对DNA的吸收以提高DNA的转化率[27]。

5.4 嗜肺军团菌：嗜肺军团菌是G-胞内致病菌，T4SS的毒力岛基因座是Dot/Icm系统，至少由DotC、DotD、DotF、DotG和DotH五种蛋白组成，其中DotF和DotG是内膜蛋白，DotC、DotD和DotH为外膜蛋白，DotF蛋白依靠DotC和DotD蛋白依附在内膜上，以构成完整的T4SS，并分泌效应分子从而引起强烈的免疫反应[33]。

5.5 鲍曼不动杆菌：CsuA/BABCDE基因簇是鲍曼不动杆菌的T4SS，主要调控菌毛的合成组装，其中，CsuE编码菌毛亚单位,CsuC组装菌毛，CsuC表达分子伴侣引导合成系统，伴侣蛋白具有结合和稳定菌毛亚单位和防止菌毛亚单位水解的功能，而引导蛋白则可以在细菌外膜形成孔道，与伴侣蛋白共同作用组装和分泌菌毛，这是鲍曼不动杆菌生物膜形成的重要环节[34]。

5.6 巴尔通体：巴尔通体是一种G-杆状苛氧寄生菌，不仅会引发奥罗亚热，还会引发秘鲁疣，其主要致病机制是通过T4SS基因编码Trw，特异性黏附人红细胞，从而导致红细胞内菌血症，中后期导致人红细胞溶解，发展为非常严重的溶血性贫血[35]。

5.7 流感嗜血杆菌：该菌中的GI亚型ICEHin1056是一种新型的T4SS，无菌毛，但是基因岛EHin1056发生突变的菌株Rd11会有纤长的菌毛，表明T4SS对菌毛形成有重要影响[35]。

5.8 革兰阳性菌：有研究表明，G+细菌中的T4SS有完全不同的共轭转移模式，例如在G+放线菌中，T4SS将整合性移动元件和质粒的复合物作为DNA转移的中间产物由供体转移给受体[23]。

6 小结 T4SS是目前研究发展最快的分泌系统之一，除了传递DNA外，与其他分泌系统最大的区别就是通过直接接触的方式运输蛋白质及核糖核蛋白复合物等大分子物质；同时，它还拥有具备ATP功能的一套完整体系，不仅传递抗性基因引发细菌的耐药性，还会传递毒力因子，与细菌的致病性大有关联。因此，对于T4SS的深入研究，不仅为针对多重耐药菌感染的靶向药物开发提供理论依据，同时，还为通过T4SS降低细菌毒力、增强细菌自溶等途径，从根源切断细菌的播散和流行提供思路。

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