外源性神经生长因子对形觉剥夺性近视豚鼠巩膜组织的保护作用及其机制

张 新, 巨朝娟, 金 鑫, 熊朝晖, 赵 燕

（河北医科大学第一医院眼科，河北 石家庄 050031）

近视是指在放松状态下，平行光线经眼球屈光系统后聚焦在视网膜前的屈光状态。近年来，近视的发生率在我国呈上升趋势，其中病理性近视的发生会引起巩膜、视网膜和视神经病变，最终导致视觉损伤，严重影响青少年的正常生活［1-2］。Wnt/β -catenin 信号通路是机体中重要的信号通路，与动物胚胎组织发育、干细胞分化和细胞增殖密切相关［3］。前期研究［4-5］显示：形觉剥夺性近视（formdeprivation myopia，FDM）动物模型中巩膜成纤维细胞的Wnt/β-catenin 信号通路被激活。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经细胞生长调节因子，通过促进乙酰胆碱的合成激活Wnt/β-catenin信号通路，从而减轻胆碱能神经元的功能障 碍［6］。研究［7-9］显示：部分活性 因子如成 纤 维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等参与近视的发生发展过程。但目前国内外对NGF的研究较少，尚无关于NGF对FDM动物Wnt/β-catenin 信号通路影响的相关研究报道。本研究建立豚鼠FDM 模型，给予外源性NGF 干预，观察NGF 对FDM 的保护作用，并阐明其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器雄性豚鼠48只，2月龄，体质量100～130 g，购自中科生物制药股份有限公司，动物使用许可证号： SYXK（冀）2019-001。适应性饲养1周，饲养条件：室温25℃±2℃，相对湿度45%～55%，昼夜交替饲养，自由进水和摄食。复方托吡卡胺滴眼液和盐酸奥布卡因滴眼液（参天制药株式会社），NGF（美国Sigma公司），TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司），鼠抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 β，GSK-3β）抗体和兔抗β-连环蛋白（β-catenin）抗体（美国Abcam 公司），鼠抗β-actin 抗体（南京金斯瑞生物科技有限公司）。SW-2100 型眼科A/B 超声诊断仪（天津市索维电子科技有限公司），CX21型显微镜（日本Olympus 公司），9700 型PCR 扩增仪（上海赛默科技生物发展有限公司），GE-100 型凝胶电泳仪（杭州博日科技有限公司）。

1.2 FDM 模型建立、分组和给药将48只豚鼠随机分为对照组、模型组、低浓度NGF组和高浓度NGF组，每组12只。依据参考文献［10］ 方法建立豚鼠FDM 模型： 采用单眼遮盖法，除对照组外，其余各组豚鼠均右眼戴－10.0 屈光度（diopte，D）透镜，左眼不进行任何处理。造模10 d后，低浓度NGF组豚鼠右眼注射500 BU NGF，高浓度NGF组豚鼠右眼注射1 000 BU NGF，连续给药21 d，左眼不进行任何处理。

1.3 各组豚鼠双眼D 和眼轴长度检测给药结束后由同一名实验人员分别采用红外偏心验光仪和眼科A/B 超声诊断仪检测各组豚鼠双眼D 和眼轴长度，在测量前30 min 给予各组豚鼠1% 复方托吡卡胺散瞳，于暗室内检影，以D 记作等效球镜的一半。采用盐酸奥布卡因滴眼液点双眼表面麻醉豚鼠，采用眼科A/B 超声诊断仪测量各组豚鼠眼轴长度。

1.4 HE 染色观察各组豚鼠巩膜组织病理形态表现各组豚鼠脱颈椎处死后摘取双侧眼球，于冰台上沿角膜缘剪开眼球，分离眼前节和玻璃体，取巩膜组织，采用多聚甲醛溶液固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片（切片厚度5 μm），采用二甲苯脱蜡，乙醇洗脱，浸洗后采用HE 染色，洗涤，采用乙醇脱水，中性树胶封固，置于光学显微镜下观察各组豚鼠巩膜组织病理形态表现。

1.5 实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantificative PCR，RT-qPCR）法检测各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β、β-catenin 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表达水平各组取6只豚鼠，分离右侧巩膜组织，按照试剂盒说明书提取总RNA 并检测浓度。GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 特 异性引物 根据基因CDS 序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计及合成。GSK-3β 引物：上游5′-CCTTAACCTGGTGCTGGACT-3′，下 游5′-AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA-3′，扩增片段长度为300 bp；β-catenin引物：上游5′-GCTGACCAAACTGCTAAATGACGA-3′，下游5′-TGTAGGGTCCCAGCGGTACAA-3′，扩增片段长度为192 bp；VEGF引 物： 上 游5′-GCAGAATCATC-ACGAAGTGG-3′，下游5′-ATCAGGGGCAC-ACAGGAT-3′，扩增片段长度为141 bp ；β -actin 引 物： 上 游5′-CACCAACTGGGACGACAT-3′，下 游5′-ATCTGGGTCATCTTCTCGC-3′，扩增片段长度为138 bp。选用25 μL 扩增体系，扩增条件：94℃预变性5 min，94℃、60 s，55℃、60 s，72℃、40 s，共35个循环，72℃、10 min。取5 μL PCR产物与上样缓冲液充分混匀，采用1.5% 琼脂糖凝胶电泳，GIS 凝胶图像处理系统成像，采用图像分析系统行光密度扫描，以β-actin 为内参进行半定量分析，目的基因表达水平采用2-ΔΔCt法计算。

1.6 免疫组织化学法检测各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin阳性细胞率取各组豚鼠巩膜组织石蜡切片，常规脱蜡复水，采用3% 过氧化氢溶液于37℃处理10 min，消除内源性过氧化物酶，加 入GSK-3β 一 抗（1∶100）和β -catenin 一抗（1∶300）于4℃孵育12 h。辣根过氧化物酶复合物（horseradish peroxidase，HRP）溶液孵育2 h，DAB 显色8min，加入苏木素复染5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，采用中性树胶封片。GSK-3β 阳性细胞为细胞浆呈黄褐色，β-catenin 阳性细胞为细胞浆或细胞核呈黄褐色。采用Image Pro Plus 多媒体彩色病理图像分析软件进行分析，分别计 算6个400 倍视野中的GSK-3β 和β -catenin阳性细胞率。GSK-3β 和β -catenin 阳 性细胞率＝GSK-3β 和β-catenin 阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7 Western blotting 法检测各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达水平取巩膜组织，加入组织裂解液处理30 min ，匀浆处理，12 000 r·min－1离心10 min，收集上清液，采用蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。取60 μg 蛋白样品经10% 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酸铵（SDSPAGE）凝胶电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯膜［poly（1，1-difluoroethylene），PVDF］，室温封闭1 h。加入GSK-3β 一抗（1∶1 000）和β-catenin 一抗（1∶500），于4℃孵育过夜，加入HRP 标记的IgG 孵育2 h，加入ECL 进行显色。采用图像软件Image J 进行定量分析，以目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组豚鼠D 和眼轴长度，豚鼠巩膜组织 中GSK-3β、β -catenin 和VEGF mRNA 表 达 水平，巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 阳性细胞率，巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达水平，符合正态分布，均以±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组豚鼠双眼D 和眼轴长度各组豚鼠左眼D 和眼轴长度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组豚鼠右眼D 明显降低（P＜0.05），右眼眼轴长度明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，低和高浓度NGF组豚鼠右眼D 明显升高（P＜0.05），右眼眼轴长度明显减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组豚鼠双眼D 和眼轴长度Tab.1 D and axis lengths of eyes of guinea pigs in various groups（n=12，±s）

表1 各组豚鼠双眼D 和眼轴长度Tab.1 D and axis lengths of eyes of guinea pigs in various groups（n=12，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration D Right eye 3.42±0.28 0.75±0.16*1.60±0.50△2.21±0.62△#Left eye 3.36±0.31 3.40±0.48 3.33±0.41 3.43±0.44 Axis length of eye (l/mm)Right eye 7.34±0.20 10.17±0.34*8.93±0.37△8.06±0.36△#Left eye 7.40±0.23 7.56±0.28 7.50±0.22 7.44±0.30

2.2 各组豚鼠巩膜组织病理形态表现对照组豚鼠巩膜组织结构完整，细胞排列整齐，未见明显异常。与对照组比较，模型组豚鼠巩膜组织厚度减少，胶原纤维排列紊乱，纤维之间出现明显空隙。与模型组比较，低和高浓度NGF组豚鼠巩膜组织厚度增加，结构相对清晰；与低浓度NGF组比较，高浓度NGF组豚鼠巩膜组织结构完整，纤维排列紧密。见图1。

图1 各组豚鼠巩膜组织病理形态表现（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of scleral tissue of guinea pigs in various groups（HE，×200）

2.3 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β、β -catenin 和VEGF mRNA 表达水平与对照组比较，模型组豚鼠右眼巩膜组织中β-catenin 和VEGF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低和高浓度NGF组豚鼠右眼巩膜组织中GSK-3β mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），β-catenin 和VEGF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；与低浓度NGF组比较，高浓度NGF组豚鼠右眼巩膜组织中GSK-3β mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），β-catenin 和VEGF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of GSK-3β, β-catenin，and VEGF mRNA in scleral tissue of guinea pigs in various groups (n=6，±s）

表2 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of GSK-3β, β-catenin，and VEGF mRNA in scleral tissue of guinea pigs in various groups (n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration GSK-3β mRNA 0.340±0.021 0.329±0.022 0.283±0.023△0.215±0.020△#β-catenin mRNA 0.162±0.013 0.261±0.019*0.359±0.033△0.415±0.029△#VEGF mRNA 0.114±0.014 0.293±0.024*0.342±0.026△0.387±0.033△#

2.4 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 阳性细胞率对照组豚鼠巩膜组织中有少量GSK-3β和β-catenin 蛋白表达。与对照组比较，模型组豚鼠虹膜组织中β-catenin 阳性细胞率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低和高浓度NGF组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 阳性细胞率降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），β-catenin 阳性细胞率明显升高（P＜0.05）；与低浓度NGF组比较，高浓度NGF组豚鼠巩膜组织中β-catenin 阳性细胞率明显升高（P＜0.05）。见图2 和表3。

表3 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 阳性细胞率Tab.3 Rates of GSK-3β 和β-catenin positive cells in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，x±s，η/%）

图2 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 阳性细胞的表达（免疫组织化学，×400）Fig.2 Expressions of GSK-3 β and β -catenin positive cells in scleral tissue of guinea pigs in various groups（Immunohistochemistry，×400）

2.5 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达水平与对照组比较，模型组豚鼠巩膜组织中β-catenin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低和高浓度NGF组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），β-catenin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与低浓度NGF组比较，高浓度NGF组豚鼠巩膜组织中β -catenin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图3 和表4。

表4 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of GSK-3β and β -catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，±s）

表4 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of GSK-3β and β -catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration GSK-3β protein 0.280±0.032 0.264±0.035 0.143±0.030△0.131±0.026△β-catenin protein 0.145±0.026 0.189±0.021*0.254±0.035△0.362±0.037△#

图3 各组豚鼠巩膜组织中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of GSK-3β and β-catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups

3 讨 论

目前国内外学者在治疗近视的研究中普遍采用豚鼠建立FDM 模型，其主要原因是豚鼠具有发育完善的视觉系统和类似人类的眼球结构［11］。巩膜是决定眼球形状和焦距的结缔组织，近视的病理特点主要以巩膜组织变薄和巩膜细胞外基质结构变化为主［12］。本研究结果显示：模型组豚鼠右眼D 低于对照组，而眼轴长度则明显增加；HE 染色结果表明：FDM 处理后豚鼠巩膜组织变薄，胶原纤维疏松、紊乱，表明巩膜组织细胞外基质重塑，导致右眼D 和眼轴长度发生变化，说明豚鼠FDM 模型建立成功。

Wnt 信号通路是维持细胞增殖和生长的重要通路，参与机体免疫应激、细胞修复与重塑等生理环节，与胚胎发育、干细胞的分化和组织再生有密切关 联［13］。GSK-3β是Wnt信号通路下游的调控酶，参与细胞分化、增殖、凋亡和炎症反应等多种病理过 程［14］。β-catenin 是Wnt信号通路的关键信号分子，具有介导信号转导和细胞间黏附作用，其在细胞中的表达水平对该通路起决定性作用，是该信号通路激活的标志，因此Wnt 信号通路也称为Wnt/β -catenin信号通路［15］。田楠楠等［16］研究显示：Wnt/β -catenin 信号通路可以激活VEGF mRNA，参与近视的发生发展。在正常情况下，Wnt/β -catenin信号通路在巩膜组织中处于静止状态，当受到病理性损伤时，Wnt/β-catenin 信号通路被激活，参与近视的发生发展过程［17］。本研究结果显示： 与对照组比较，模型组豚鼠右眼巩膜组织中VEGF mRNA、β-catenin mRNA 和蛋白表达水平明显升高，与PENG 等［18］研究结果一致，表 明FDM处理使巩膜组织受损，β-catenin 通过提高活性抑制巩膜细胞在异常状态下发生凋亡，同时巩膜组织受损促进了VEGF 表达。NGF 是基底前脑胆碱能神经元的营养因子，主要通过增加神经营养维持神经突起生长和促进神经细胞修复，保护神经元退变［19］。采用NGF 干预后，豚鼠右眼巩膜组织中GSK-3β mRNA 表达水平降低，VEGF 和β-catenin mRNA 及蛋白表达水平升高，表明NGF 能够通过改善巩膜组织胆碱能神经元抑制GSK-3β 表达，从而促进β-catenin 表达，维持内环境稳定性，并促进VEGF 表达诱导和促进新生毛细血管形成，减轻组织损伤［20-21］。

综上所述，病理性近视会引起巩膜、视网膜和视神经病变，外源性NGF 可通过抑制GSK-3β 表达、增加β-catenin表达和激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进新生毛细血管形成，对FDM 豚鼠的巩膜组织起保护作用。