PI3K/Akt信号通路与缺血性中风的相关性研究进展

白秀 沈亚亭 王明威 张旭龙 谢西梅

缺血性中风是由于脑组织短暂或持续性的缺血、低氧而导致脑功能发生障碍的一种大脑不可逆性损伤，这一过程中伴随着细胞凋亡、自噬、氧化应激以及炎性反应等关键环节的发生，PI3K/Akt信号转导通路作为细胞内外信号应答的途径之一，能发生一系列级联反应串扰在这些环节中，产生错综复杂的有益调节作用[1,2]。然而，随着缺血性中风病理程度的加重，这一信号通路原有的生物调节活性被抑制，信号转导被中断，丧失了在这一病理过程中的有益作用。近年来，随着对这一信号通路研究的深入，发现西药、中药单体以及针灸等干预可重新激活这一信号通路。以下笔者对PI3K/Akt信号通路的生物学基础，及其串扰在缺血性中风机制中的作用进行阐释。最后总结西药、中药单体以及针灸对该通路已有的研究成果，为缺血性中风的防治提供理论基础。

1 PI3K/Akt信号通路的分子生物学基础

PI3K是存在于细胞内并能产生特异磷酸化反应的一种磷脂肌醇激酶，本身并存有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶和磷脂肌醇激酶的活性，具备多种生物学功能，在大多数组织中都有表达。因其在结构和功能上的差异，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中研究最多且与脑缺血关系最紧密的是Ⅰ型PI3K，由调节亚基p85和催化亚基p110构成，极易被生长因子、细胞因子等胞外信号通过表面受体(酪氨酸激酶或G-蛋白偶联受体)激活。活化后的亚基可进一步启动PI3K的激活，促使其发出复杂的募集运动，进而被召唤并迁移至邻近质膜上发生磷酸化反应，使3,4-二磷酸磷脂酰肌醇 (PIP2) 转变为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[3,4]。PIP3作为第二信使转导分子继续发挥磷酸化作用将其活化信号传至膜内信号蛋白Akt。

Akt是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，也是一类抗凋亡调节因子，于1977年Staal等[5]研究一种逆转录病毒时第一次被发现，同时因其与蛋白激酶A和C有极高的相似性,又被命名为蛋白激酶B，主要分为Akt1、Akt2、Akt3三种功能不同的亚型。其中Akt1和Akt3参与细胞的增殖、存活的过程，并对细胞的形态与数目有关键的调节作用[6,7]。同时，Akt作为PI3K/Akt信号通路的核心效应器，含有特殊的PH结构域，有重要的催化和调节效能，这一结构域一旦缺失或变异就可致使Akt活性低下甚至失活。依赖于PI3K的活化，Akt的PH结构域可与PI3K生成物PIP3相互识别并结合，进而使Akt从胞内迁移至胞膜上并发生构像改变，充分暴露出Ser/Thr蛋白并使其磷酸化，最终Akt彻底被激活[8,9]。活化后的Akt可进一步实现对下游底物的调控作用，引起信号转导通路的级联反应，对细胞的凋亡和周期产生关键的调节作用。

2 PI3K/Akt信号通路与缺血性中风发病机制的关系

PI3K/Akt信号转导通路作为关键的级联信号途径之一参与了缺血性中风发生、发展过程，串扰在细胞凋亡、自噬、氧化应激及炎性反应等多种机制中，并处于核心地位。

2.1 细胞凋亡 细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡模式，是缺血性中风中典型的病理特征之一，受多种基因的综合调控，如Bcl-2家族、细胞色素C、Caspase家族、NF-κB家族。这一复杂模式的发生伴随着各种信号通路的转导，1999年的一项研究显示PI3K/Akt信号通路参与了缺血性中风这一病理过程，且与缺血程度相关[10]。在缺血性中风发生初期，这一信号通路被激活发生一系列复杂的磷酸化级联反应进而延缓细胞凋亡的进程[11]。这一过程主要经过以下4条途径实现：(1)活化后的Akt可促使Bcl-2家族成员Bad的Ser136位点发生磷酸化，进而能与伴侣蛋白14-3-3结合形成复合物，与此同时，抗凋亡蛋白Bcl-2或bcl-XL形成的异源二聚体中的促凋亡蛋白Bad即可脱落下来，增加了胞内Bcl-2或bcl-XL等的游离状态，从而发挥抗凋亡作用[12]；(2)活化的Akt在维持线粒体转换孔自身的稳定性的同时还能抑制Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道，这样的双重作用可减少细胞凋亡级联反应上游线粒体细胞色素C的释放量从而发挥抑制细胞凋亡作用[13]；(3)活化后的Akt可磷酸化Caspase-9的Ser196 位点使其失活，进一步抑制Caspase-3下游分子发生的一系列级联反应进而抑制细胞凋亡；(4)脑缺血发生后打破了正常状态下Akt下游效应分子NFκB中的p50/p65/NFκB抑制蛋白(IκB)形成的三聚体复合物的稳定状态，并在脑缺血的持续刺激下，可有效激活IκB激酶并使其进行降解，从而将p65亚基的DNA位点与p50亚基的易位信号暴露出来，导致NFκB和IκB解除联系，经由转位方式NFκB从胞膜转移至胞核与DNA结合进一步启动炎性反应加速细胞凋亡进展，活化的Akt抑制该过程的发生，维持NFκB中三聚体复合物的稳定状态，从而抑制细胞凋亡的发展[14]。

2.2 自噬 自噬是细胞在各种应激情况下对自身的分解代谢过程。在脑缺血的发生过程中自噬有着双重作用。缺血初期，神经细胞在缺血低氧的状态下可激活细胞自噬进而对受损的神经细胞发挥保护效应。自噬系统激活后，其降解产物可进一步转化合成三磷酸腺苷(APT)为受损的神经细胞提供能量。然而随着脑缺血程度的加重，细胞自噬随之加重，随着自噬水平的过度增高，导致神经细胞自噬性死亡[15]。mTOR作为PI3K/Akt信号通路下游重要的靶标之一，对胞内多种信号有调控作用，并在细胞增殖分化、凋亡和自噬中扮演着重要角色。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞自噬中发挥了关键的调节作用[16-18]。正常情况下，通过激活酪氨酸激酶受体进而激活PI3K，将其底物PIP2催化为PIP3，PIP3进一步与相应激酶协同作用激活Akt，P-Akt继续磷酸化下游底物mTOR，活化后的mTOR将信号继续下传至下游相关分子，进而促进细胞增殖、分化及蛋白合成，加快细胞代谢，抑制其过度自噬。然而在脑缺血状态的持续加重下，PI3K/Akt/mTOR信号通路的转导能力逐渐被削弱，从而这种有效抑制被逐渐消除。有研究发现0～36 h缺血海马神经元P-PI3K、P-Akt、p-mTOR的表达成下降趋势，自噬相关蛋白表达成上升趋势[19]。另有文献报道显示间歇性低氧可上调脑缺血后自噬水平，加重神经功能障碍程度，并表明其效应机制与抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性有关[20,21]。

2.3 氧化应激 氧化应激是由于体内活性氧和氮物质增加，氧化应激防御系统减少引起，缺血期间脑内产生大量活性氧和自由基，自由基的连锁反应可导致神经细胞死亡，尤其对初始缺血损伤的神经细胞攻击性更强。而在脑缺血发作初期，PI3K/Akt信号通路被激活，一方面活化后的Akt可磷酸化其下游重要靶标丝/苏氨酸蛋白激酶GSK-3β发生磷酸化，GSK-3β是细胞内抑制糖原合成的激酶，可调控线粒体转换孔及NFκB发挥作用，磷酸化的GSK-3β失去了增加ATP的释放和激活NFκB的能力，从而减轻氧化应激对脑组织的损伤。另一方面活化后的Akt可进一步活化具有激活氧化应激防御机制作用的核因子E2相关因子2(Nrf2)，从而影响Nrf2与其调节路径Keap1偶联，并使Nrf2转移至胞核内，识别并结合抗氧化基因启动子ARE，从而增强醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶1(HO-1)等抗氧化蛋白的表达，减轻缺血再灌注对神经细胞的损伤程度[22]。

2.4 炎性反应 在缺血性中风的病理过程中，炎性反应引起的过度免疫反应是神经细胞损伤的重要机制。该病的发生必然伴随着活性氧的产生，活性氧可促使炎症细胞活化并释放大量炎性因子入血，目前的主流观点认为肿瘤坏死因子TNF-α和白介素代表因子IL-6作为中心炎性介质入血后导致白细胞过度激活、血管内皮细胞以及白细胞表面黏附分子的表达增加，这些不利因素都增加了神经细胞的广泛损伤，促使继发性脑损伤的进展。大量文献报道显示，内皮型一氧化氮合酶eNOS作为Akt磷酸化后下游的关键底物之一，依赖于Akt的活化发生磷酸化，进一步生成NO，NO作为一种内皮细胞松弛因子，广泛存在于脑组织中，一方面能够有效缓解缺血性中风急性发病时血压急剧升高导致颅内血管痉挛、闭塞甚至血肿等不利情况，发挥保护效应；另一方面NO能够减轻炎性介质对神经细胞的浸润程度，降低白细胞和血小板在细胞壁上的粘连程度，促进血管重构，从而适应缺血缺氧的生理环境，产生脑保护作用[23-26]。此外，活化后的Akt还能抑制其下游另一效应介质NFκB介导的炎性反应，从而延缓神经细胞凋亡进程。

3 PI3K/Akt信号通路的转导及干预对缺血性中风的影响

生理条件下，PI3K/Akt信号通路作为机体经典的促增殖、抗凋亡途径，活化的PI3K/Akt在保证神经元正常功能及维持正常凋亡水平方面有着至关重要的作用。研究证实，在脑缺血再灌注的病理损伤过程中PI3K/Akt通路的转导活性逐渐被抑制，通过干预触发并激活该通路，可扭转过度凋亡趋势，从而使脑缺血再灌注损伤程度有所减轻[27]。

3.1 西药对PI3K/Akt信号通路的影响 迄今为止，西药一直是临床治疗缺血性中风的主要方法，但西药的药理作用极为复杂，涉及面极为广泛。近十年来，关于西药在信号通路的探索取得了一定突破。有报道显示δ-阿片受体激动剂(DADLE)作为一种新型神经保护剂，通过激活Gi/Go偶联的δ-阿片受体刺激Akt信号，再者该受体还可通过酪氨酸蛋白激酶(Src)依赖的胰岛素样生长因子(IGF-1)受体的反式激活调节PI3K，一方面加速促凋亡蛋白Bad磷酸化失活，另一方面促使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而达到抗神经细胞凋亡作用[28-30]。另有学者利用LY294002验证丁基苯酞是否通过对PI3K/Akt/GSK3β信号通路的调节起到保护局部脑损伤的作用机制的研究中发现，丁基苯酞可介导PI3K来实现Akt和GSK3β的磷酸化进程，降低受损脑组织中神经细胞的凋亡水平，同时在后期参与修复过程，对于缺血后脑梗死的面积的扩大有抑制作用[31]。此外，相关实验显示维甲酸α受体激动剂Am80可促使Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，提高Akt的磷酸化水平，并在使用PI3K抑制剂Wortmannin后可阻断Am80的作用[32]。说明维甲酸α受体激动剂Am80的神经保护机制可能是介导PI3K/Akt信号通路达到的。另有研究者在建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型后，经股静脉给与右美托咪定干预，检测分析结果显示，缺血区脑组织中p-Akt(Ser473)、内皮型一氧化氮合酶p-eNOS(Serl177)的表达水平上调，为取得进一步验证，给与PI3K阻断剂LY294002或内皮型一氧化氮合酶(eNOS)阻断剂L-NIO后发现，右美托咪定干预的原有趋势被逆转[33]。表明右美托咪定可经上调PI3K/Akt,促使eNOS磷酸化激活进而减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤程度。

3.2 中药单体对PI3K/Akt信号通路的影响 目前,国内外学者关于中药活性单体在缺血性中风的动物实验中发现，各种中药活性单体可直接或间接作用于PI3K/Akt信号通路发挥其神经保护作用。有学者在研究槲皮素的神经保护机制时发现槲皮素可显著改善MCAO大鼠神经功能，降低梗死体积，并增加了大鼠脑部缺血区域脑源性神经营养因子(BDNF)、p-Akt蛋白表达，而PI3K抑制剂LY294002或受体拮抗剂可阻断槲皮素诱导的大鼠相同脑缺血部位BDNF和p-Akt蛋白的升高[34]。认为槲皮素能降低缺血后脑组织损伤程度，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关，并有望成为未来脑缺血后发挥神经保护效应的潜在药物。另有实验发现，具有抗氧化和抑制凝血酶作用的羟基红花黄色素A(HSYA)可增加脑缺血大鼠缺血半影区Akt和GSK3β的磷酸化程度，并对此缺血区细胞凋亡数目有明显的下调作用[35]。表明HSYA有一定的脑保护作用，其效应机制可能是通过PI3K/Akt/GSK3β信号途径实现的。此外，有研究显示，红景天苷可降低脑缺血模型大鼠脑组织细胞凋亡水平，促使该缺血区p-Akt、Bcl-2、神经营养因子(BDNF)和HO-1的表达，降低炎症相关因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达，且前后这两种表达趋势都可被LY294002逆转[36]。这说明红景天苷的神经保护的分子机制可能与PI3K/Akt信号途径的激活有关。另有学者研究发现姜黄素可减轻脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性及脑水肿，抑制细胞凋亡，提高PI3K、Akt蛋白活性，增加Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达，这说明姜黄素的脑保护作用是通过穿透血脑屏障后激活PI3K/Akt信号通路产生的[37]。

3.3 针灸对PI3K/Akt信号通路的影响 针灸作为一种外源性刺激疗法一直是治疗缺血性中风的中医有效手段之一，历史悠久，疗效确切，目前得到了国内外学术界广泛认可。近年来，随着新技术新方法的不断涌现，该领域逐渐深入到细胞、分子层面，其中关于细胞内信号转导的研究引起了广泛关注，尤其是涉及PI3K/Akt信号通路的研究逐渐增多。有研究者以神经细胞凋亡为着眼点观察不同时机介入针刺法对幼鼠脑缺血后PI3K/Akt信号通路的影响，发现不同时间介入针刺治疗都可降低细胞凋亡数量，上调PI3K、Akt的表达，下调Caspase-3的表达，并表明早期干预效果更佳[38]。提示针刺可加强PI3K/Akt信号通路的激活，抑制神经细胞凋亡，对缺血脑损伤幼鼠的神经具有保护作用。有学者研究发现针刺醒脑开窍针法主穴人中、内关、三阴交可改善脑缺血大鼠缺血海马组织病理损害程度，降低海马组织细胞凋亡数量，而在该缺血海马组织检测到p-Akt、Bcl-2蛋白呈现高表达[39]。提示醒脑开窍针法在脑缺血损伤过程中的保护作用可能与PI3K/Akt信号通路的激活有一定联系。另有文献报道显示，对脑缺血大鼠进行电针干预后缺血脑组织中PI3K、p-Akt、Bcl-2的表达量增加，Caspase-3阳性表达受到抑制，并在阻断此通路后，p-Akt、Bcl-2表达消失，电刺激和针刺的有益效应被削弱[40-42]。表明电针的正性调节作用可能与PI3K/Akt信号通路的激活密切相关。认识到针灸对这一信号途径的有益调节作用后，相关实验在使用三七总皂苷(PNS)的基础上叠加针灸疗法观察对急性缺血性大鼠的神经行为学情况及血脑屏障的保护作用，结果显示对比单纯使用PNS治疗，针药联合治疗效果更佳，且PI3K/Akt信号途径相关分子的表达情况较单纯使用PNS更可观[43]。表明PNS结合针灸对急性缺血性大鼠有显著的脑保护作用，其效应机制可能与激活PI3K/Akt信号通路并加强其转导有关。以上从PI3K/Akt信号通路角度探讨了针灸在脑缺血中效应机制，初步得出结论：针灸可借助对PI3K/Akt的调控作用进而对脑缺血导致的脑损害发挥了一定的保护作用，间接表明针灸经络与细胞内信号转导之间存在一定联系。

PI3K/Akt信号通路作为生物体内重要的转导通路，在维持生物体内正常代谢平衡外，同时参与多种疾病的病理过程。缺血性中风是由多种病理因素共同作用而形成，PI3K/Akt信号通路作为细胞生存的关键途径之一在该病发生、发展进程早期被激活，并串扰缺血后诱导的细胞凋亡、自噬、氧化应激及炎性反应等重要机制中，发生一系列级联反应进而启动对受损的神经细胞的产生保护作用，然而随着缺血程度的加重其活性逐渐被抑制导致神经细胞的凋亡加速发展。此外，目前国内外针对PI3K/Akt信号通路在缺血性中风的靶向研究中发现，内源性的西药、重要单体作用和外源性的针灸刺激可重新激发并唤醒这一信号通路，使其恢复原有的信号转导能力，从而进一步发挥对神经细胞的有益效能，这为治疗缺血性中风提供了新的靶点。