载酶塑料填料的制备与优化

王洪海，尹依，刘星，魏斯文，苏伟怡，李春利

（1 河北工业大学化工学院，天津 300130；2 化工节能过程集成与资源利用国家地方联合工程实验室，天津 300130）

反应精馏（RD）将反应过程与分离技术耦合在一个装置内，是新型强化工艺技术[1]。在RD 中通常使用强酸或强碱作催化剂，但它们回收困难，而且可能造成严重污染[2]。生物酶具有环境友好性，近年来已广泛用于替代传统催化剂[3-4]。将酶催化应用到反应精馏中即为酶催化反应精馏（ERD），这一工艺可以高效利用反应精馏的优势，提升酶催化反应的效率[5]，因此，ERD 具有提高酯化行业技术水平和经济效益的潜力[6]。

南极假丝酵母脂肪酶B（CaLB）是一种优异的生物催化剂，不仅具有高活性、立体选择性和操作稳定性[7-8]，而且它的耐热性较强，失活温度可达50～60℃，然而，游离态CaLB 存在不稳定、有机溶剂耐受性差、难以回收再利用等缺点[9]，限制了其应用。近年来，研究者使用各种固定化酶的方法如共价结合、包埋、吸附和交联等[10-11]，以提高酶的稳定性、高效回收率和可重复使用性[12]。溶胶-凝胶包埋法不仅可以增强生物酶的稳定性，而且能够维持酶结构，因此被广泛应用于ERD 工艺中[13]。例如，Heils 等[14]首次使用溶胶-凝胶法将酶固定在规整填料上并在RD 柱中催化酯交换反应。因为CaLB 被固定在硅烷前体经过水解、缩聚而成的三维网络中，所以在催化酯交换反应过程中，外部基质可以自由扩散到硅凝胶的内部发生催化反应，同时转化产物扩散至凝胶外部[15]。

溶胶-凝胶包埋法在ERD中的应用已经取得很大的进步，但是，对凝胶材料稳定性的研究仍存在一些挑战，特别是凝胶材料质地较脆，容易发生龟裂现象[16]，这将造成载酶涂层严重脱落，从而降低催化剂的循环使用性，增加工艺成本。生物催化剂的性质取决于酶和载体材料，而凝胶配方各组分的相对含量直接影响凝胶基质和酶的性能[17]。凝胶配方中的有机改性硅凝胶（MTMS）可以克服材料的脆性，增强凝胶的韧性，提高涂层的黏附力[18]，而且MTMS是含有机官能团的疏水性硅胶，可以实现酶分子与SiO2网络之间的特殊键合，从而有效保留酶的活性[19]。

塑料填料质地轻、耐腐蚀、不易破裂、加工方便、价格低廉，与金属填料相比，它更符合绿色化学理念。在新型填料开发和应用的背景下，聚丙烯填料具有优异的物理、化学性能，在中国已经成为使用最广泛的塑料填料之一[20-21]。在已有的研究中尚未发现使用塑料填料制备负载型催化填料的详细研究，因此，本文选择聚丙烯填料进行固定化酶的初步研究。

在这项工作中，首次使用聚丙烯为原料的鲍尔环填料与溶胶-凝胶包埋法结合制备载酶塑料填料。选择正丁醇（BuOH）与乙酸乙酯（EtAC）在70℃下的酯交换反应作为模型反应[22]。由于原配方[23]（本文作者课题组先前工作中使用的凝胶配方称为原配方）制备的载酶涂层存在明显的开裂情况，进而对凝胶配方进行优化以适用于塑料填料。结果表明优化后塑料载酶涂层开裂现象得以改善，通过黏附力表征、循环使用性以及酶学稳定性测试结果得出载酶塑料填料有希望应用于ERD工艺。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与材料

主要试剂：乙酸乙酯，乙醇，正丁醇，甲醇，乙酸正丁酯，AR，天津市大茂化学试剂厂；甲基三甲氧基硅烷和聚乙二醇400，AR，上海阿拉丁试剂有限公司；正硅酸甲酯，AR，天津希恩思生产科技有限公司；氟化钠，AR，天津市风船化学试剂科技有限公司。南极假丝酵母脂肪酶B，诺维信公司。聚丙烯鲍尔环，填料直径、高度分别为16mm、16mm，萍乡市海川化工有限公司。所有化学药品均为分析纯，无需进一步处理。

1.2 载酶填料的制备

在本文作者课题组先前研究[23]的基础上优化了溶胶-凝胶的配方且将金属填料改为聚丙烯填料，基体制备过程如下。①交联剂的配制：将一定质量比的正硅酸甲酯（TMOS）、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）和甲醇（MeOH）混合称为A 液。②溶剂的配制：将一定质量比的聚乙二醇（PEG400）、氟化钠、去离子水、CaLB 酶液混合称为B 液。③因为前体水解过程中会产生大量的热，为了避免这一过程放出的热对生物酶造成严重损害，所以先将A液和B 液分别在0℃冰水浴中搅拌冷却1min，再将A液缓慢多次的倒进B液中，混合液继续在冰水浴中搅拌冷却约3min。④将商用喷枪以恒定的速度从距离填料15cm 的高度Z 字形喷涂，喷射流量为1.82kg/h，喷射压力为0.1bar（1bar=0.1MPa），为了防止喷枪的气流喷除掉刚刚涂覆到填料表面的溶胶溶液，在喷涂过程中使用吹风机辅助干燥。喷涂完成后，将其放置在室温下干燥至恒定质量，即得到载酶塑料填料，4℃下储存备用。制备过程如图1所示。

图1 载酶填料的制备过程

1.3 表征方法

利用荷兰Philips公司的XL30-TMP型扫描式电子显微镜（SEM）分析配方优化前后填料表面凝胶涂层的形貌及形态。

使用德国布鲁克公司的VECTOR22 型傅里叶红外光谱（FTIR）分析凝胶的化学组成。

用兰州中科凯华科技开发有限公司的WS-2005 型自动划痕仪测量涂层的黏附性能。压头尖端的半径为200μm、采用0～50N 的动态载荷加载范围、加载速度为0.5N/min，划痕长度为4mm。在声发射模式下，产生的第一个声发射信号载荷值即为涂层黏附力数值。涂层的黏附强度用式(1)计算。

式中，F为第一声发射信号所处载荷值，N；P为涂层的黏附强度，MPa；S为压头与涂层的接触面积，m2。

在深圳新三思计量公司的CMT-6104型材料万能试验机上使用10kN 传感器进行单轴压缩试验，加载速度为2mm/min，测量凝胶的机械性能。

载酶填料分别放置于70℃下的间歇反应体釜中，使用电动搅拌器对反应体系进行搅拌，搅拌速率均为400r/min，使反应釜中的载酶填料近似模拟精馏塔中反应段的环境，反应4 次（每次30min）测试载酶填料的循环稳定性。

1.4 酶活力测试

本文使用水解活性的方法测定固定化酶和游离酶的酶活，利用酶催化4-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP，5.0mg/mL）水解生成对硝基苯酚（p-NP）的原理。水解酶活的定义：在测试条件下，单位时间（1min）内，释放单位产物p-NP（1μL）所需要的酶量，定义为1U。具体的，在3mL 的磷酸缓冲液（PBS，0.1mol/L，pH7.5）中加入20mg 的固定化酶粉（或200μL 的游离酶），放置于37℃的集热式恒温加热磁力搅拌器上搅拌5min，随后在上述缓冲溶液中加入200μL的p-NPP，在室温条件下使用旋涡混合器将其震荡30s保证混合均匀，再放回集热式恒温加热磁力搅拌器中持续反应3min，迅速取出过滤得到上清液，利用紫外分光光度计在410nm 的波长处测量吸光值，根据上清液中p-NP的含量，计算固定化酶（或游离酶）的酶活。

1.5 蛋白固载率的测定

采用考马斯亮蓝[24]测定固定化酶CaLB 的蛋白含量，参考牛血清蛋白（BSA）的标准曲线，分析游离酶和固定化酶的磷酸盐缓冲洗涤液中脂肪酶的含量，计算固定化之前游离酶的蛋白含量和固定化之后洗涤液中的蛋白含量，两者的差值即为蛋白固载量。蛋白固载率的计算公式为式(2)。

式中，C0为原酶液的蛋白含量，mg/mL；C1为固定化后洗涤液中的蛋白含量，mg/mL。

1.6 催化效率

正丁醇（BuOH）和乙酸乙酯（EtAC）酯交换反应在间歇反应釜中进行。向四口烧瓶中加入EtAC 和适量的催化剂，将BuOH 放入锥形瓶中，分别加热至70℃，然后将BuOH 迅速加入烧瓶中。反应在恒温水浴中进行5h[23]。在此期间，每30min取样一次，通过气相色谱（GC）分析评估BuOH的转化率。（反应条件：酯醇摩尔比为2∶1，催化剂质量为正丁醇的10%。）

1.7 游离酶和固定化酶的酶学性质测试

为了测试优化后配方制备的固定化酶的酶学性能，对其热稳定性、有机溶剂耐受性、储存稳定性和可重复利用性进行了测定，与游离酶CaLB 进行比较。将游离酶和固定化酶的初始活性均设定为100%，计算孵育后的酶活性。在每次测试之后，用大量缓冲溶液清洗，再测试另一个环境下的酶活性，每个实验做3次，以确保结果的可靠性。相对酶活的计算如式(3)。

（1）热稳定性测试

在70℃、pH 7.5 的PBS（0.1mol/L）缓冲溶液中共孵育8h，每2h 测量并计算残留的酶活性，用以表征游离CaLB和固定化酶的热稳定性。

（2）有机溶剂稳定性测试

将含酶量相同的游离酶CaLB 和固定化酶分别放置在乙酸乙酯溶剂中，在室温下孵育20h研究有机溶剂的耐受性，采用式(3)测试残留酶活性。

（3）储存稳定性测试

将游离酶CaLB 和固定化酶在室温下放置60天，相同时间间隔（每10 天）取出样品测量并计算相对酶活性，以此来评估游离CaLB 和固定化酶的储存稳定性。

（4）固定化酶的可重复使用性

为了研究此固定化酶在酯交换反应中的重复使用性，分次反应6 个周期（每次反应2h）。在每个循环结束后，通过抽滤、洗涤和干燥回收催化剂，然后用于新一轮的催化反应。定义固定化酶反应前的初始活力为100%，通过与初始活力比较来计算固定化酶的剩余活性，以此来评定固定化酶催化剂的重复使用性。

2 结果与讨论

2.1 溶胶-凝胶配方优化

在实验初期，多次使用原配方喷涂至塑料填料表面制备载酶塑料填料，发现载酶涂层均存在明显的开裂现象。这种开裂会降低载酶涂层与填料基体的结合强度，导致涂层严重脱落[25]，原因可能是凝胶基质的脆性较大，在曲率较小的塑料填料表面开裂问题被放大，说明原配方不适合应用于塑料基体。为了实现塑料填料固定化酶，提高总体经济效益，必须改善凝胶开裂问题。因为凝胶配方各组分的相对含量直接影响凝胶基质的性能，所以有必要优化凝胶配方以改善凝胶基质脆性，提高塑料载酶涂层的稳定性。对凝胶配方的主要组分：硅烷前体甲基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的质量比（MTMS/TMOS）、CaLB、PEG400 和水的加入量进行了研究。

2.1.1 硅烷前体的优化

硅烷前体的比例对包埋酶的活性和凝胶结构有很大影响。考察MTMS 与TMOS 的质量比对固定化酶活性和蛋白固载率的影响，实验结果如图2 所示。当MTMS 与TMOS 的质量比增大时，酶活性和固载率的比例先增大后减小，在质量比为3.5∶1时达到最大值。在原凝胶配方中，MTMS 与TMOS 的质量比为3∶1，这说明优化后MTMS 的含量增加。凝胶基质的疏水性取决于疏水性硅烷（MTMS）与亲水性硅烷（TMOS）的比例，因此MTMS 的增加可以增强凝胶的疏水性；又因为脂肪酶CaLB 是一种界面活性酶，所以凝胶基质的疏水性有利于维持分子构象并增强酶的活性[26]；此外，TMOS 具有优异的网络形成能力[27]，若其相对质量过高，在凝胶的干燥过程中可能会由于过度收缩导致涂层破裂和酶活性损失。因此，适当增加MTMS的相对含量可改善材料的脆性且增强酶活性[13]。

图2 硅烷前体对酶活和蛋白固载率的影响

2.1.2 游离酶添加量的优化

酶的加入量是固定化过程中的关键因素，它直接影响固定化酶的“相对活性”[19]。实验结果如图3 所示，随着CaLB 质量分数的增加，酶活提高，加入的酶几乎被完全包埋，所以蛋白固载率基本不变；然而，当CaLB 的质量分数大于23%时，固定化酶CaLB 的活性几乎保持不变，而蛋白固载率显著降低。通常，随着酶质量分数的增加，相应的结合位点增加，酶与底物的结合效果更好[26]。但是，当酶的质量分数超过一定量时，酶分子不能被完全包埋，容易产生团聚现象，导致酶活性和蛋白固载率下降。因此，选择CaLB 的最佳质量分数为溶胶总质量的23%。与原配方相比，优化凝胶中包埋的酶数量有所增加。

图3 游离酶添加量对酶活和蛋白固载率的影响

2.1.3 PEG400添加量的优化

PEG400 具有良好的生物相容性，它可以先于脂肪酶吸附在凝胶材料的表面，减弱凝胶与脂肪酶之间的相互作用，更好地保持酶活性[26,28]；而且适量的PEG400 能调节凝胶的孔结构。当PEG400 含量低时，它对硅烷前体的水解和缩聚过程影响很小，仅起到分散剂的作用，不足以为凝胶制孔。当PEG400 含量较高时，由于聚乙二醇链结构在溶胶颗粒表面的包覆作用，溶剂层的厚度增加，因此无法使凝胶形成规则的孔道[28]。

实验结果如图4 所示，随着PEG400 含量的增加，固定化酶活性和蛋白固载率增加；然而，当其质量分数超过1.4%后，酶活性和蛋白固载率均呈下降趋势。因此，PEG400 的添加量为溶胶总质量的1.4%。适量的PEG400有利于形成均匀的孔隙分布，防止因孔坍塌导致涂层开裂[28]。

图4 PEG400加入量对酶活和蛋白固载率的影响

2.1.4 水添加量的优化

水的含量是影响凝胶基质结构和包埋效果的另一重要因素。实验结果如图5所示，固定化酶的活性和蛋白固载率随水加入量增加而逐渐增加，当水的质量分数超过12%时，固定化酶CaLB 的活性和蛋白固载率下降。水的加入量较低时，前体不能被完全水解，大量Si—OR 基团的存在使得缩聚形成的Si—O—Si 网络化程度很低，极易引起凝胶层开裂[19]，此外，水含量过低，在SiO2网络形成过程中会发生醇缩合，不利于酶的固定化[29]；当水含量过高时，凝胶网络可以提供更多的微水环境，酶分子倾向于停留在水相中，这可能导致凝胶化过程的延长[19]，降低酶活性和蛋白固载率。因此，水的加入量被确定为溶胶总质量的12%。

图5 水的量对酶活和蛋白固载率的影响

2.2 优化后硅凝胶的性能

使用优化后的溶胶-凝胶配方，制备载酶塑料填料，并对其性能进行表征。

2.2.1 SEM分析

使用优化后的配方制备了载酶填料，通过SEM 图可以观察到填料表面凝胶涂层的形态。从图6(a)可以看出，原配方制备的载酶涂层存在多处裂纹，而图6(b)表明优化后涂层几乎没有明显的裂纹，说明配方优化改善了凝胶的脆性开裂问题。证明优化配方适用于塑料填料固定化酶。

图6 塑料填料载酶涂层的SEM图

2.2.2 红外光谱分析

FTIR被广泛应用于分析样品中官能团的变化。图7为优化前后凝胶粉末的红外光谱图，新配方没有添加或去除任何组分，因此官能团数量没有变化，仅峰面积发生变化。在波长1645cm-1和3412cm-1处对应CaLB的—NH2伸缩振动峰，两处峰面积均变大表明凝胶网络中包埋的酶量增加[30]。波长1411cm-1处的峰归因于Si—CH3的拉伸振动，Si—CH3是MTMS 的独特官能团，其峰变大，说明凝胶中MTMS相对含量增加。此外，硅烷前体的水解程度可以通过Si—O—C 的拉伸振动来评估，该拉伸振动对应于1039cm-1的谱带[31]，其峰面积变小，意味着硅烷前体的水解程度增加。从峰面积的变化可以看出，配方中各组分相对含量的变化对硅烷前体的水解、缩聚过程起促进作用。

图7 配方优化前后凝胶粉末的红外光谱图

2.2.3 凝胶材料抗压性

使用材料测试机对配方优化前后制备的干凝胶的机械性能进行测试[31]。通常，较低的机械强度会导致凝胶涂层开裂[32]。测试结果如图8所示，当干凝胶经压缩时，应力-应变曲线以阶梯式上升，在达到峰值后快速下降，此特征表明凝胶基质是脆性材料，破坏模式为脆性断裂[31,33]。在压缩过程中，当应力达到5.79MPa时，原配方凝胶上出现明显的断裂现象，优化后的凝胶仅出现少量微裂纹。结果表明配方优化改善了凝胶材料的脆性，提高了凝胶的韧性[34]。

图8 两配方制备干凝胶的应力应变曲线

2.2.4 黏附强度

黏附强度是评估涂层性能的重要依据[35]。在声发射模式中，涂层的黏附强度由划痕断裂产生的第一声发射信号的载荷值表示。抗划痕实验结果如图9所示，原配方制备的载酶涂层在载荷值5.3N时开始被破坏，由式(1)计算可得，原配方涂层附着力为42.198MPa， 而优化配方涂层附着力为48.169MPa。表明脆性问题的改善可以提高涂层与基体的黏附强度[34]，使载酶涂层与填料的附着力提高了14.2%。优化配方制备的载酶填料与本文作者课题组先前使用的金属载酶填料的黏附强度值相近[36]。因为金属载酶填料已成功进行精馏实验[23]，所以塑料填料制备的载酶涂层有希望应用于ERD工艺。

图9 配方优化前后载酶涂层的黏附强度

2.2.5 循环稳定性

载酶填料的循环稳定性不仅是评估催化剂工业应用潜力的重要特征之一，而且决定精馏工艺的经济成本。为了进一步表征载酶填料的稳定性，将优化前后两配方制备的载酶填料在反应釜中搅拌反应，测试各循环反应后的涂层损失率。载酶涂层从塑料填料上脱落的质量分数如图10所示，在反应4次后，优化配方载酶填料的质量损失为18.66%，而原配方载酶涂层的损失为26.35%。可以看出改善凝胶开裂问题后，涂层与基体黏附强度提高，涂层脱落率降低，有利于提高精馏工艺的经济效益。

图10 两配方制备的载酶填料的循环稳定性

2.2.6 催化效率

通过酶活性测试，得到游离CaLB 的酶活性为(510±17)U/g，原配方制备的固定化酶活性为(484±12)U/g，优化后的酶活性为(496±11)U/g，可能是因为优化后被包埋酶的含量增加，酶活有一定提高。比较了两配方制备的催化剂在间歇反应釜中酯交换反应的催化效率，结果如图11 所示，虽然最终的平衡转化率基本一致，但是原配方催化的反应在240min 达到平衡，优化后反应在210min 平衡。因此，使用优化配方制备的固定化酶催化剂具有更好的催化效果和酶活力。

图11 配方优化前后的催化效率对比

通过上述分析可以得出，配方优化不仅提高了凝胶机械强度，改善了凝胶涂层开裂，减少了涂层的质量损失，而且提高酶的活力和催化性能。接下来探讨优化配方制备的固定化酶的酶学稳定性。

2.3 游离酶和固定化酶的酶学性质

生物酶催化剂的稳定性在工业应用中至关重要。当固定化酶具备优异的稳定性和长效性时才能实现在工业上的大规模应用[37]。在本研究中，采用热稳定性、有机溶剂稳定性、储存稳定性和循环稳定性来评估配方优化后酶的固定化效果。

2.3.1 热稳定性

良好的热稳定性是工业应用的关键。游离酶和固定化酶的热稳定性如图12 所示，将初始酶活设为100%，在70℃、PBS 缓冲溶液中，随着孵育时间的延长，固定化酶的相对酶活高于游离酶CaLB。孵育8h后，游离酶的相对酶活仅为8%，而固定化酶的相对酶活高达77%，表现出优异的耐热性。通常，在高温下游离脂肪酶的蛋白结构易被破坏[38]，酶在凝胶中的原位包埋有效阻止酶的二级结构变化，从而保护酶的蛋白质结构，降低其变性程度，因此，固定化酶具有较高的热稳定性。

图12 游离酶和固定化酶在70℃环境下的热稳定性

2.3.2 有机溶剂稳定性

将游离酶CaLB 和固定化酶浸泡在乙酸乙酯溶剂中，测定其有机溶剂耐受性。结果如图13所示，随时间延长相对酶活均降低，孵育20h后游离酶的相对酶活为51%，但固定化酶的相对酶活仍能维持在83%。这是因为包埋后凝胶三维网络结构对CaLB 起了一定的保护作用，提高了酶的刚性并阻止了酶在恶劣条件下的构象变化[39]，有机溶剂稳定性明显提高。

图13 游离酶和固定化酶的有机溶剂耐受性

2.3.3 储存稳定性

储存稳定性是固定化酶在工业应用中的关键因素之一。将固定化酶和游离酶在室温下放置一段时间，评定其储存稳定性，初始酶活定义为100%。实验结果如图14所示，固定化酶在储存60天后仍保持86%的相对活性，游离酶表现出更快的分解速度，相对酶活仅为53%，活性降低的原因主要有两方面：①随着时间延长，酶活性的自然丧失；②酶溶液可作为微生物的营养来源而被分解，因此，在储存过程可能会发生自溶[40]。凝胶载体可以为酶提供适宜生存的孔结构，不仅可以防止蛋白分子构象转变，还会阻止环境中的微生物与酶蛋白接触[39]。因此，固定化酶具有优异的长期储存稳定性。

图14 游离酶和固定化酶的储存稳定性

2.3.4 重复使用性

以乙酸乙酯和正丁醇为底物测试各循环反应的相对活性，研究固定化酶的可重复利用性。实验结果如图15 所示，随着反应次数的增加，相对酶活逐渐降低，在循环反应6次后，固定化酶的相对活性为67%，且活性趋于稳定。表明此固定化酶具有较强的可重复使用性，为其在酶催化的工业应用中降低成本。

图15 固定化酶的重复使用性

3 结论

（1）本文首次使用塑料填料固定化酶，发现了凝胶载酶涂层的开裂现象。

（2）对凝胶配方进行优化，优化结果如下：硅烷前体（MTMS∶TMOS）的质量比为3.5∶1；酶、PEG400、水的质量分数分别为23%、1.4%、12%。

（3）通过优化配方，改善了凝胶材料的脆性和涂层与填料之间的黏合强度，降低了涂层损失率，说明此配方制备的载酶塑料填料稳定性较优异，符合绿色可持续发展理念。证实了塑料填料固定化酶的可行性，为进一步在ERD 中应用奠定了基础。

（4）测定了优化配方制备的催化剂的酶学稳定性，结果表明此固定化酶具有优异的热稳定性、有机溶剂耐受性、储存稳定性及可重复利用性。