血清外泌体miR-24水平与老年进展性腔隙性脑梗死、颈动脉硬化的关系*

张选琴，罗 丹

重庆医科大学附属第一医院大足医院/重庆市大足区人民医院神经内科，重庆 402360

腔隙性脑梗死属于缺血性脑梗死的一种亚型，部分呈亚急性或进展性。腔隙性脑梗死患者因穿支动脉供血区闭塞、急性坏死而缺血，在大脑半球深部或脑干形成病灶，其特点是易形成圆形或卵圆形、直径为3～15 mm、充满液体的腔隙。根据病变部位不同，腔隙性脑梗死可出现多种并发症，如血管性认知功能障碍。多数腔隙性脑梗死患者病情较轻，预后良好，但仍有部分患者，尤其是老年患者，由于合并多种危险因素，易在发病数小时至1周内发生神经功能进一步损伤加重，即发展为进展性腔隙性脑梗死，而国内外尚缺乏有效的治疗手段阻止这一疾病进展[1]。颈动脉粥样硬化斑块是引起脑梗死的可能原因之一，在狭窄部位下游的血管区域易引起腔隙性血管病变，而且颈动脉硬化对进展性腔隙性脑梗死也有一定的预测价值。JIANG等[2]学者通过建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，发现miR-24在大鼠大脑中动脉闭塞模型中表达降低，且该模型的脑梗死面积百分比和血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平也升高。故本研究通过分析血清外泌体miR-24水平与老年进展性腔隙性脑梗死、颈动脉硬化的关系，为腔隙性脑梗死进展机制和预防治疗提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2018年5月至2020年6月收治的急性腔隙性脑梗死患者120例为研究对象，其中男75例，女45例；年龄65～89岁，平均(73.40±6.85)岁；根据病情是否进展将患者分为进展组32例，非进展组88例。纳入标准：(1)首次发病；(2)经头颅MRI弥散加权序列技术确诊，符合第四届脑血管学术会议制定的腔隙性脑梗死诊断标准；(3)完善头颅三维时间飞跃磁共振血管成像(3D TOF-MRA)和(或)头颅电子计算机断层扫描(CT)检查，证实有与症状、体征相符的出血病灶；(4)发病至入院时间≤48 h；(5)患者年龄≥65岁。排除标准：(1)心源性梗死、大动脉炎引发的脑梗死或再发脑梗死；(2)合并脑外伤、脑出血或颅内占位性病变；(3)合并感染性疾病、恶性肿瘤或心、肝、肾功能障碍。所有研究对象均自愿参与本研究，并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会批准，且遵循《赫尔辛基宣言》。

1.2方法

1.2.1收集基础资料 收集所有患者的基线资料，包括年龄、性别、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分(入院当天及入院后7 d)、脑血管疾病危险因素(包括吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、高脂血症史)；入院1 d内进行体格检查；采用全自动血细胞计数仪(日本希森美康XS-900i型)进行血常规检测，包括白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、中性粒细胞绝对值(NEU#)、淋巴细胞绝对值(LYM#)等；采用全自动生化分析仪(日本日立3100型)检测TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、HDL-C和空腹血糖(FBG)。

1.2.2病情进展判断 患者入院后7 d复查NIHSS评分相较入院时增加≥2分，视作病情进展。

1.2.3颈动脉超声检查 所有患者入院时，使用高分辨率的Philips ie33彩色多普勒超声仪评估双侧颈总动脉(CCA)、颈总动脉分叉部(BIF)、颈内动脉颅外段(ICA)的颈内动脉中层厚度(IMT)，每组3次，平均IMT取左右两侧CCA远端1 cm处的平均值。以局限性内膜增厚≥1.2 mm或≥50%周围IMT，且局部隆起，向管内突出，定义为斑块形成。根据超声检查结果显示的回声性质确定斑块的稳定性：易损斑块(局部低回声、等回声或混合回声)、稳定斑块(高、强回声)。根据Crouse积分法评估斑块严重程度，评分为双侧颈动脉CCA、BIF、ICA部分的近端、远端分数总和(0～12分)。

1.2.4血清外泌体提取及鉴定 所有患者入院时采集清晨空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，在—80 ℃低温冰箱中储存待测。外泌体根据外泌体分离试剂盒(Invitrogen Life Technologies公司)说明书分离，将血清离心(30 min，8 000 r/min)去除细胞和碎片，然后将获得的上清液与外泌体分离试剂充分混合，在4 ℃下孵育30 min，再在室温下离心(10 min，10 000 r/min)去除上清液，试管底部的外泌体用磷酸盐缓冲液重悬。将提取的血清外泌体置于透射电子显微镜下观察。采用Western blot法检测CD61、CD9、TSG101、CYC1和GRP94蛋白表达情况。方法如下：利用RIPA蛋白酶裂解液(上海联迈生物科技有限公司)提取外泌体总蛋白，使用二喹啉甲酸标准曲线法定量蛋白水平，取蛋白30 μg进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%)分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上。应用含5%脱脂奶粉的洗膜缓冲液室温封闭1 h后，加入CD61(1∶1 000)、CD9(1∶1 000)、TSG101(1∶1 500)、CYC1(1∶1 000)和GRP94(1∶2 000)一级抗体(英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜，然后用TBST冲洗3次，每次10 min。再加入二级抗体抗孵育1 h，用TBST冲洗3次，每次10 min。利用Odyssey双色红外荧光成像系统(美国LI-COR公司)分析蛋白电泳条带的灰度值，计算蛋白表达量，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。所有试验均重复 3 次，取平均值。

1.2.5血清外泌体miR-24水平检测 将外泌体标本与TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司)混合，裂解提取总RNA。采用Agilent 2100生物分析仪检测RNA标本的完整性和水平。用PrimeScriptTMRT试剂盒(大连Takara Biotechnology公司)和5 μL RNA标本配制15 μL反转录反应体系，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。将获得的cDNA标本储存在—20 ℃低温冰箱中。miR-24引物片段扩增使用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒(大连Takara Biotechnology公司)，选择小分子U6作为内源性参考基因。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40个热循环。所有反应均平行进行3次，取均值表示。测定Ct值，以2—ΔΔCt法计算结果，用参考基因U6 mRNA作为血清表达的内部标准化控制。miR-24引物序列：正向5′-TGTTCCTGCTGAACTGAGCC-3′，反向5′-CTCTGCCTCCCGTGCCTA-3′；U6 mRNA引物序列：正向5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向5′-CAGGGCCATGCTAATCTT-3′。

2 结 果

2.1非进展组和进展组基线资料比较 非进展组与和进展组的年龄、性别、体质量指数、危险因素(吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、高脂血症史)、入院时NIHSS评分、PLT、LYM#、TG、HDL-C等指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。进展组WBC、NEU#、TC、LDL-C、FBG水平均明显高于非进展组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者基线资料比较

组别n血常规检查(x±s,×109/L)WBCPLTNEU#LYM#实验室检查(x±s,mmol/L)TCTGHDL-CLDL-CFBG进展组327.95±1.13207.53±33.105.52±0.891.55±0.375.07±1.451.47±0.351.19±0.223.22±1.128.33±3.17非进展组887.18±1.04198.94±24.565.10±0.741.67±0.404.48±1.031.41±0.321.10±0.272.68±0.957.14±2.43χ2/t3.5041.5372.6011.4822.4740.8861.6912.6232.180P0.0010.1270.0100.1410.0150.3780.0940.0100.031

2.2血清外泌体提取及鉴定结果 将提取的血清外泌体置于透射电子显微镜下观察，典型的显微照片显示囊泡呈圆形或椭圆形，直径为30～150 nm，见图1。经Western blot法检测，在分离出的外泌体颗粒标本中出现外泌体蛋白标记CD61、CD9、TSG101蛋白特异性条带，而在外泌体缺失的上清液中没有特异性条带；此外，CYC1和GRP94蛋白呈阴性表达。见图2。

图1 血清外泌体透射电镜下观察囊泡形态(×12 000)

图2 外泌体标志蛋白表达情况

2.3非进展组和进展组血清外泌体miR-24水平比较 入院时非进展组和进展组血清外泌体miR-24水平分别为1.00±0.09和0.76±0.21，进展组血清外泌体miR-24水平明显低于非进展组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4进展性腔隙性脑梗死发生的影响因素分析 以进展性腔隙性脑梗死(进展=1，未发生进展=0)作为因变量，将WBC、NEU#、TC、LDL-C、FBG、血清外泌体miR-24作为自变量，对进展性腔隙性脑梗死的影响因素进行多因素Logistic回归分析，结果显示血清外泌体miR-24降低，NEU#和LDL-C水平升高是急性腔隙性脑梗死患者发生进展的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 多因素Logistic回归分析进展性腔隙性脑梗死的影响因素

2.5入院时血清外泌体miR-24水平对进展性腔隙性脑梗死的预测价值 ROC曲线分析结果显示，入院时血清外泌体miR-24预测进展性腔隙性脑梗死的AUC为0.793(95%CI：0.650～0.861)，cut-off值为0.805，在该阈值下，特异度和灵敏度分别为92.5%和58.6%。见图3。

图3 血清外泌体miR-24预测进展性腔隙性脑梗死的ROC曲线

2.6两组颈动脉斑块检出情况、IMT、Crouse积分比较 进展组和非进展组患者分别检出65块和123块颈动脉斑块，进展组斑块检出率高于非进展组，且易损斑块检出率更高，差异有统计学意义(P<0.05)；另外,进展组Crouse积分高于非进展组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组颈动脉斑块检出情况、IMT、Crouse积分比较

2.7血清外泌体miR-24水平与颈动脉斑块Crouse积分的关系 经Pearson相关分析，miR-24水平与颈动脉斑块Crouse积分呈负相关(r=—0.793，P<0.001)。见图4。

图4 血清外泌体miR-24水平与颈动脉斑块Crouse积分的相关性

3 讨 论

本研究分析了急性腔隙性脑梗死患者血清外泌体中miR-24水平与疾病进展之间的关系，结果表明发生腔隙性脑梗死且症状出现7 d内发生疾病进展的患者入院时血清外泌体miR-24水平低于未发生进展的腔隙性脑梗死患者，经多因素Logistic回归分析，发现miR-24水平降低是进展性腔隙性脑梗死发生的独立危险因素，说明miR-24可能与急性腔隙性脑梗死的疾病进展有关。既往研究证实，颈动脉硬化和斑块形成是急性脑梗死疾病进展的独立危险因素，但是单纯的颈动脉彩超检测往往不能准确预测腔隙性脑梗死的进展，并发现检测急性腔隙性脑梗死患者入院时血清外泌体miR-24水平对腔隙性脑梗死患者的病情进展有一定的预测价值，且外泌体中的miRNA可有效避免被血清中的RNA酶降解，因此，检测血清外泌体中的miR-24水平预测进展性腔隙性脑梗死更加准确[1-2]。

在我国，脑梗死具有很高的发病率、病死率和致残率，且目前尚缺乏十分有效的治疗手段和控制神经功能恶化的有效措施。因此，明确与脑梗死发生、进展相关的危险因素具有重要的医学价值。动脉粥样硬化被认为是脑梗死最重要的病理性基础[3-4]。LORENZ 等[5]的前瞻性研究发现，颈动脉IMT可以独立预测未来的脑血管事件。因此，颈动脉粥样硬化斑块的形成及引起的颈动脉狭窄已被广泛用作预测脑梗死疾病发生的指标，并且也是疾病治疗中控制的关键因素。除此以外，颈动脉粥样硬化斑块与脑梗死神经功能恶化的相关性及其临床意义也逐渐被证实。神经系统恶化是急性腔隙性脑梗死患者最严重的并发症之一[6]。多种因素被认为会导致急性腔隙性脑梗死神经系统恶化，包括大血管闭塞、颈动脉粥样硬化斑块的形成、斑块易损性、出血转化、颅内压升高、感染等。潘维花等[7]证实，24 h收缩压标准差、颈动脉硬化Crouse积分与脑梗死密切相关，是腔隙性脑梗死发生、进展的有效预测指标。作为一种廉价、无创、非电离的成像技术，颈动脉超声检查斑块是目前唯一能实时观察动脉壁形态、血流动力学和弹性特征的成像方法，但是对于无急性症状发作的腔隙性脑梗死患者或疾病进展评估，其灵敏度和临床应用范围有限。

本研究通过多因素Logistic回归分析证实，miR-24水平降低是腔隙性脑梗死发生疾病进展的独立危险因素，且ROC曲线分析结果显示，检测血清外泌体miR-24水平对于预测进展性腔隙性脑梗死的发生具有较高的灵敏度。miR-24在眼、肾、脑、心、肺等多种组织中均有表达，特别是在血管组织中。有研究表明，miR-24可以通过抑制Importin-α3表达，调节内皮细胞的增殖、迁移、凋亡及炎性反应来抑制动脉粥样硬化[8-12]。方丹等[13]证实在不稳定性动脉斑块中存在高水平的YKL-40及低水平的miR-24。目前，进展性腔隙性脑梗死的可能发病机制有穿支血管动脉硬化性疾病、血流动力学变化、兴奋性氨基酸毒性和炎性反应等，此外，大血管病变也极有可能引起动脉-动脉栓塞或穿支动脉入口被斑块阻塞，从而引发腔隙性脑梗死。OHIRA等[14]和靳宗伟等[15]均通过研究证实CCA-IMT、Crouse积分升高与缺血性脑梗死的相关性相较于其他型脑梗死更大，尤其与腔隙性脑梗死关系密切。本研究中患者入院时进展组斑块检出率高于非进展组，且易损斑块检出率更高，差异均有统计学意义(P<0.05)；另外，进展组Crouse积分明显高于非进展组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明颈动脉斑块硬化程度越严重，腔隙性脑梗死患者发生疾病进展的风险越高。相关分析发现，血清外泌体miR-24水平与颈动脉斑块Crouse积分呈负相关，提示miR-24与颈动脉斑块的形成机制有关，检测miR-24水平可反映颈动脉粥样硬化的严重程度。

综上所述，miR-24水平可以反映腔隙性脑梗死患者颈动脉斑块硬化严重程度，而且其降低是急性腔隙性脑梗死发生疾病进展的独立危险因素，检测血清外泌体miR-24水平对预测老年进展性腔隙性脑梗死的发生具有较高的价值。