中老年骨关节炎患者肿瘤坏死因子-α、钙网织蛋白表达与疾病严重程度的相关性*

刘小莉，邹 明，张 静，张红梅

四川省骨科医院检验科，四川成都 610041

骨关节炎是以关节表面软骨遭到破坏，而周围骨性组织增生为病理特征的关节病，可导致受累关节产生疼痛，活动时加重，久不活动时有僵硬感[1]。骨关节炎在年龄超过50岁的人群中发病率较高，严重影响中老年人的身体健康及生活质量。骨关节炎病变部位分泌物的检测对反映关节代谢状态有重要作用，检测其中特异性分子将有助于判断该病的病理变化，对临床早期诊断具有重要意义[2]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种促炎性细胞因子，参与免疫反应、炎性反应等，在重症类风湿关节炎患者血液中可发现TNF-α升高[3]。钙网织蛋白(CRT)是一种内质网主要钙结合蛋白，参与机体多种生理、病理过程。研究报道，CRT与类风湿关节炎患者关节滑膜炎性反应和血管形成有关[4]。目前，对于中老年骨关节炎患者体内TNF-α、CRT水平的相关研究较少。本研究以95例中老年骨关节炎患者为研究对象，探讨中老年骨关节炎患者体内TNF-α、CRT表达情况，并分析二者水平与疾病严重程度的关系，为中老年骨关节炎的临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2020年2月本院收治的95例中老年骨关节炎患者纳入病例组。纳入标准：(1)符合骨关节炎诊断标准[5]，X线片等影像学检查结果显示滑膜、骨赘增生，半月板、侧副韧带磨损及膝关节内外翻畸形；(2)年龄55～80岁；(3)对本研究内容知情，并签署同意书。排除标准：(1)合并急性或慢性感染性疾病、出血性疾病；(2)合并严重骨质疏松、骨纤维异常或骨性融合；(3)合并心、肝、肾、肺功能障碍。病例组包括男55例，女40例；年龄55～80岁，平均(65.12±2.07)岁；病程1～5年，平均(3.46±1.03)年；单膝患病83例，双膝患病12例；病理类型包括软骨型12例，滑膜型18例，游离体型7例，半月板型15例，混合型43例。根据Michel Lequesen膝骨关节炎严重度分级指数(ISOA)[6]将95例中老年骨关节炎患者分为中度组30例，重度组46例，极重度组19例。另外选取同期因交叉韧带断裂行手术治疗的患者60例为对照组，留取其滑膜液和手术切除的正常滑膜组织，其中：男29例，女31例；年龄56～80岁，平均(64.52±4.67)岁。病例组和对照组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会审批通过。

1.2方法

1.2.1获取关节滑膜组织和滑膜液 在关节镜检查或行膝关节腔穿刺、冲洗术及其他相应手术时，注入1.0 mL的生理盐水，反复回抽、注入3遍，将最后一次抽出的液体注入生化管中，以3 000 r/min离心5 min，于20 ℃冰箱保存备用。取关节滑膜组织，大小2 cm×2 cm，甲醛固定，室温保存。

1.2.2酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TNF-α、CRT水平 采用ELISA法检测滑膜液中TNF-α、CRT水平，ELISA法检测试剂盒由默沙克生物科技有限公司提供。

1.2.3吸光度值(A值)检测 吸取100 μL关节滑膜液、稀释标准品，36%孵箱避光孵育90 min，加入生物素化抗体，孵育60 min，加入酶结合物，再次孵育30 min，加入显色底物孵育15 min，加入终止液，于450 nm波长检测A值，绘制标准曲线。

1.2.4免疫组化法检测滑膜组织中TNF-α、CRT表达情况 取滑膜组织标本，浸腊包埋后，依次进行切片、烤片、脱蜡水化、封闭内源性酶；BSA溶液孵育1 h，加入兔抗人TNF-α抗体及CRT抗体，孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染细胞，并进行脱水、透明、封片，观察结果。阳性细胞呈棕褐色，阴性表达呈淡黄色或浅棕色。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；等级资料相关分析采用Spearman相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同严重程度骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比较 中度组、重度组、极重度组骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；重度组、极重度组骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明显高于中度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，极重度组骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明显高于重度组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同严重程度骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比较

2.2滑膜组织中TNF-α、CRT的表达情况 正常滑膜组织中未见TNF-α表达(图1A)，TNF-α在中老年骨关节炎滑膜组织中呈阳性表达，表达位于滑膜衬里层，且有大量炎性细胞浸润(图1B)；CRT在正常滑膜组织中呈阴性表达(图1C)，在中老年骨关节炎滑膜组织中呈阳性表达，表达主要位于血管周围和滑膜衬里层，表达量较低(图1D)。

2.3各组滑膜组织中TNF-α、CRT的A值比较 中度组、重度组、极重度组骨关节炎患者滑膜组织中TNF-α、CRT的A值明显大于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；重度组、极重度组骨关节炎患者滑膜组织中TNF-α、CRT的A值明显大于中度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，极重度组骨关节炎患者滑膜组织中TNF-α、CRT的A值明显大于重度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组滑膜组织中TNF-α、CRT的A值比较

注：A为正常滑膜组织中TNF-α表达情况；B为中老年骨关节炎滑膜组织中TNF-α表达情况；C为正常滑膜组织中CRT表达情况；D为中老年骨关节炎滑膜组织中CRT表达情况。

2.4滑膜液TNF-α、CRT水平与骨关节炎严重程度的相关性分析 TNF-α、CRT水平与骨关节炎严重程度呈正相关(r=0.667，P<0.001；r=0.704，P<0.001)。

3 讨 论

骨关节炎是一种慢性关节病，表现为关节疼痛、关节变形及关节活动受限等。中老年人是骨关节炎高发群体，75岁以上人群中发病率高达80%，60岁以上人群中发病率为50%[7]。该病的发生与肥胖、衰老、炎性反应及创伤等多种因素有关。人体关节表面有一层光滑组织，主要保证关节活动顺畅性，而老年人许多组织器官开始衰老，关节软骨磨损变薄，关节边缘形成骨刺，进而引发骨关节退行性病变[8-9]。随着分子生物学不断发展，血清中分子标志物的检测成为临床判断各种疾病进展的重要辅助手段。

TNF-α作为常见促炎性细胞因子，参与局部炎性反应，具有杀伤靶细胞、促细胞凋亡及内皮细胞活化作用，参与许多关节疾病，如类风湿关节炎、骨关节炎等。杨荣等[10]发现，膝关节炎患者血清中TNF-α水平明显上升，并随着关节炎严重程度的增加呈不断升高趋势。赵娜等[11]的研究显示，创伤性膝骨关节炎患者血清中TNF-α水平[(41.40±14.63)ng/L]明显高于健康对照者[(24.53±10.37)ng/L]。TNF-α在骨关节炎发病机制中最关键的作用是上调基质金属蛋白酶的表达，诱导炎性反应发生，还可刺激软骨细胞合成白细胞介素(IL)-6、IL-8等，进一步增加炎性反应[12]。本研究结果显示：对照组TNF-α水平明显低于中度组、重度组和极重度组骨关节炎患者，重度组、极重度组骨关节炎患者滑膜液中TNF-α水平明显高于中度组，极重度组骨关节炎患者明显高于重度组，即TNF-α表现为随病情加重逐渐上升趋势；TNF-α在正常滑膜组织中呈阴性表达，在骨关节炎患者滑膜组织中呈阳性表达，A值的变化趋势与其在滑膜液中的变化情况一致。经相关性分析发现，TNF-α水平与中老年骨关节炎严重程度呈正相关(r=0.667，P<0.001)，说明TNF-α能够促进中老年骨关节炎进展，加重病情，这主要与TNF-α对关节软骨的破坏有关，其通过刺激软骨降解酶及介导前列腺素合成分泌，破坏软骨组织，促进骨吸收。CRT是内质网钙结合蛋白，普遍存在于生物细胞中，在细胞质、细胞表面及细胞外基质中均有表达。研究报道，CRT参与类风湿关节炎的病理过程，与患者关节滑膜炎性反应有紧密联系[13]。滑膜血管翳的形成是关节炎的重要病理表现，新生血管向滑膜液输送炎症细胞，同时为滑膜异常增生提供氧气和营养物质，使滑膜长期处于炎性反应状态，增加血管翳的侵袭性[14]。CRT可通过多种途径参与血管翳的形成，其中关节炎的共享表位是其主要作用途径，通过该途径参与固有免疫的信号转导，最终促使血管翳形成[15]。丁红梅等[16]研究发现，活动期类风湿关节炎患者体内CRT水平较稳定期高，同时与IL-6、TNF-α等炎症因子水平呈正相关。本研究发现：CRT在病例组各亚组患者滑膜液及滑膜组织中的水平均高于对照组，同时随着疾病严重程度呈不断上升趋势，提示该指标与骨关节炎疾病进程有一定关系。相关分析显示，CRT水平与骨关节炎疾病严重程度呈正相关(r=0.704，P<0.001)，提示CRT会加重老年骨关节炎病情。本研究还发现：TNF-α在中老年骨关节炎滑膜组织中的表达位于滑膜衬里层，有大量炎性细胞浸润；CRT表达主要位于血管周围和滑膜衬里层，表达量较低。

综上所述，中老年骨关节炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平升高，并随着病情加重呈上升趋势，二者水平与该病严重程度呈正相关。TNF-α、CRT有望成为临床诊断中老年骨关节炎的潜在血清学指标。