丙戊酸钠对重度烫伤大鼠肺微血管内皮屏障的保护作用和机制研究

张文华，唐富波，胡 森，杜明华解放军总医院医学创新部 创伤修复与组织再生研究中心，北京 0085；武警四川总队医院 烧伤科，四川乐山 64000；解放军总医院第一医学中心 急诊科，北京 0085

严重烧伤后，全身炎症反应和微血管通透性增高引起血管内液体向组织中渗漏，是组织水肿和低血容量性休克的主要原因。同时，血管内皮屏障受损导致液体复苏过程中大量血管内液体进入组织及空腔脏器，减少血液循环量，加重组织水肿和脏器功能损伤，导致多器官功能障碍综合征及高病死率[1-2]。组蛋白的乙酰化修饰是基因转录调节过程中重要的组成部分，在失血性休克条件下，机体去乙酰化增强，导致细胞功能紊乱甚至死亡[2]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)能够抑制细胞的高度去乙酰化水平，在分子水平上提高细胞对致死性损伤的耐受能力，并可以减轻缺血缺氧引起的心、脑、肾等重要脏器的损伤[3]。研究发现HDACIs能提高缺氧损伤心肌细胞拮抗缺氧的能力，应用于严重烫伤、脓毒性休克和失血性休克动物模型中，可以提高机体抗炎症、抗缺氧、抗休克等能力，保护其重要脏器功能[4-5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种高度特异性的血管内皮有丝分裂素，其可以特异地作用于血管内皮细胞中的受体，在血管内皮通透性调节中起到重要作用[6-7]。近期研究表明，HDACIs能在动物实验和体外细胞实验中抑制VEGF的表达[8]。丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制药物，研究表明在失血性休克和脓毒症动物实验中丙戊酸钠可以修复组蛋白的乙酰化水平，减少重要脏器损伤，提高动物存活率。近年的动物研究发现，在严重烧烫伤动物模型中，丙戊酸钠可以保护脑、心脏和肠道等重要脏器的功能，提高存活率[9-11]。本研究将观察丙戊酸钠对50% TBSA Ⅲ度烫伤大鼠模型肺微血管内皮屏障是否具有保护作用并探讨其作用机制。

材料与方法

1 主要试剂和仪器 丙戊酸钠购自Selleck公司，VEGF、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和H3K9 ELISA试剂盒购自北京依科赛公司，甲酰胺购自Sigma公司，分光光度计购自赛默飞公司(NanoDrop Lite)。恒温干燥箱购自丹泊仪器(昆山)有限公司，全自动酶标仪购自德国Biosys公司 (Bioreader)。

2 动物模型与分组 所有动物实验均获得实验动物委员会的批准并严格依照实验动物委员会的规定及相关推荐进行。清洁级雄性SD大鼠64只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，60～70 d龄，体质量(250 ± 10) g。适应性饲养2周，实验前12 h禁食，4 h禁饮。随机分配为4组：1)NN组(n=16)，假烫后即刻腹腔内注射0.9%氯化钠注射液(100 mg/kg)；2)NV组(n=16)，假烫后即刻腹腔内注射丙戊酸钠(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化钠注射液)；3)SN组(n=16)，烫伤后即刻腹腔内注射0.9%氯化钠注射液(100 mg/kg)；4)SV组(n=16)，烫伤后即刻腹腔内注射丙戊酸钠(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化钠注射液)。腹腔内注射戊巴比妥钠注射液(50 mg/kg)麻醉满意后，背、腹部皮肤备皮；烫伤组在100℃水温下烫伤背部15 s、腹部8 s；假烫组在37℃水温下浸泡背部15s、腹部8s。烫伤/假烫后立即擦干皮肤水分并予相应治疗措施，烫伤后2 h和6 h取材。于各观察点前30 min麻醉大鼠，颈静脉注射2%伊文思蓝(20 mg/kg，20 mg/mL)，30 min后开胸，自心尖部置入冲洗管并固定，剪开右心耳，灌注37℃保存的1‰肝素盐水，冲洗至灌出液清亮 后，取肺组织放置于液氮中待测。

3 分光光度法测定肺微血管内皮通透性 取冲洗净血液及残余EB的肺组织0.2 g，装入含有2 mL甲酰胺的试管中，放置于37℃恒温水浴箱中24 h，1 500 g离心30 min，提取上清液，分光光度计于620 nm，1 cm光径比色皿检测吸光度值，根 据标准曲线得出相应EB含量。

4 干湿重法测定肺组织含水率 在吸水纸上吸去肺组织表面水分后，剪取适量新鲜肺组织，称湿重，置于90℃恒温干燥箱中，取出标本称干重( D)。肺组织含水率(%)=(W - D)/W × 100%。

5 分光光度法检测肺组织MPO活性 准确称量肺组织，以配好的试剂二溶液为匀浆介质，按照重量体积比1∶19加入匀浆介质制备成5%的组织匀浆，不需要进行离心；取5%组织匀浆0.9 mL加3号试剂0.1 mL，充分混匀后37℃水浴15 min，取出后待测；混匀，60℃水浴10 min，取出后立即用分光光度计于460 nm处，1 cm光径比色皿，双 蒸水调零，检测各管吸光度值。

6 ELISA法测定肺组织中VEGF和Ac-H3K9含量 固定时间点取组织后，立即置于液氮中。反复冻融3次后，取0.3 g组织加入0.5 mL组织裂解液，研磨后1 500 g离心5 min，取上清，冻存于-20℃冰箱中待检测。常温融化上清和ELISA试剂盒后，按照说明书要求，检测标准曲线。向试剂盒中加入100 µL上清，盖上贴纸，在避光 37℃下反应1 h。300 µL洗液洗板5次。加入底物反应液100 µL，避光、室温、摇床上反应30 min，弃去上清，洗板5次，加入HRP反应液100 µL，反应15 min，酶标仪检测450 nm处吸光度，并计算样 品浓度。

7 统计学方法 应用SPSS23.0统计软件处理，计量资料以±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0 .05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺组织微血管通透性与含水率 与假烫组相比，大鼠烫伤后2 h即出现肺伊文思蓝含量增高(P＜ 0.05)，烫伤后6 h增高更为显著(P＜ 0.05)；与NS组相比，SV组大鼠肺伊文思蓝含量在烫伤后2 h时无明显差异，在烫伤后6 h时明显降低(P＜ 0.05)。说明丙戊酸钠能够缓解严重烫伤引起的肺微血管内皮通透性增高。与假烫组大鼠相比，烫伤组大鼠烫伤后2 h肺组织含水率升高(P＜ 0.05)，烫伤6 h显著升高(P＜ 0.05)。与SN组比较，SV组肺组织含水率在烫伤2 h和烫伤6 h时均有所降低(P均 ＜ 0.05)。说明VPA能够降低严重烫伤引起 的肺组织水肿。见表1。

表1 丙戊酸钠对烫伤后肺组织微血管通透性和含水率的影响Tab. 1 Effect of sodium valproate on microvascular permeability and water content of lung tissue after scald

2 肺组织VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表达 与假烫大鼠比较，SN组和SV组大鼠VEGF水平在2 h和6 h时均明显增高(均P＜ 0.05)。烫伤2 h后，SV组与SN组VEGF水平无统计学差异；烫伤6 h后，SV组大鼠VEGF水平明显低于SN组大鼠(P＜ 0.05)。说明VPA治疗后能够有效降低严重烧伤引起的肺组织VEGF水平增高，进而降低非微血管通透性。与假烫大鼠相比，SN组和SV组大鼠MPO活性在烫伤2 h和6 h时均明显增高(P均＜ 0.05)。与SN组比较，SV组大鼠肺MPO活性在6 h时明显降低(P＜ 0.05)，差异有统计学意义，在烫伤2 h时两组间无统计学差异。说明VPA能够缓解严重烫伤引起的肺组织MPO活性升高。与NN组比较，烫伤2 h时，SN组Ac-H3K9水平开始下降(P＜ 0.05)，烫伤6 h时下降更为明显(P＜ 0.05)。SN组大鼠肺组织Ac-H3K9水平在烫伤2 h时即恢复到高于正常水平(P＜ 0.05)，烫伤6 h时增高更为明显(P＜ 0.05)，差异有统计学意义。见表2。

表2 VPA对烫伤后肺组织VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表达的影响Tab. 2 Effect of sodium valproate on VEGF content, MPO activity and Ac-H3K9 expression in lung tissue after scald

讨 论

目前烧伤后早期救治工作的重点集中在如何维持组织灌注和保护重要脏器的功能[12]。然而，因烧伤后机体微血管内皮屏障受到损伤，即使足量补充液体复苏，仍可能导致一系列严重威胁烧伤患者生命的并发症[13-14]。肺通常是严重烧伤后首先受到损伤的器官之一，大部分烧伤患者甚至在没有发生吸入性损伤和感染的情况下也会发生急性肺损伤和肺水肿。因此研究对烧伤后肺微血管内皮屏障具有保护作用的药物，对于减轻肺水肿、急性肺损伤及减少烧伤补液需求十分必要[15-17]。

本研究采用50% TBSA Ⅲ度烫伤大鼠模型探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA对烫伤大鼠肺微血管内皮屏障的保护作用。结果发现在严重烫伤后，大鼠肺微血管内皮屏障被破坏，微血管内皮通透性明显增高，肺组织水肿。VPA治疗后能保护烫伤引起的肺微血管内皮屏障损伤，降低烫伤大鼠肺微血管内皮通透性，减轻组织水肿。

组蛋白的乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一。HATs和HDACs的在生理状态下的动态平衡共同调节组蛋白的总体乙酰化水平，称为“组蛋白的乙酰化平衡”。HDACIs是去乙酰化酶活性抑制药物，可以降低组蛋白的去乙酰化水平，从而升高组蛋白的乙酰化水平，保护细胞功能。研究表明，HDACIs能够抑制失血性、脓毒症等休克条件下细胞的去乙酰化过程，恢复组蛋白的乙酰化平衡，减轻缺血缺氧引起的心、脑、肾等重要脏器的损伤[3]。丙戊酸钠是一种HDACIs类药物[18]。研究表明，在失血性休克和脓毒症动物实验中，丙戊酸钠可以修复组蛋白的乙酰化水平，减少重要脏器损伤，提高动物生存率[19]。本研究发现，正常大鼠腹腔注射丙戊酸钠后能够明显提高肺的组蛋白乙酰化水平；烫伤2 h后大鼠肺的组蛋白乙酰化水平即出现降低，烫伤6 h后乙酰化水平明显降低；烫伤大鼠经丙戊酸钠治疗后，在烫伤后2 h和6 h均能显著提高组蛋白乙酰化水平。因此猜想丙戊酸钠可能通过提高组蛋白乙酰化水平改善烫伤大鼠预后。

烧伤引起组织VEGF表达和MPO活性增加。HDACIs类药物在动物实验和体外细胞实验中抑制VEGF表达水平[20]。本研究发现大鼠严重烫伤后肺组织VEGF表达增加，MPO活性增强，同时出现肺微血管内皮通透性升高和肺水肿；严重烫伤大鼠经丙戊酸钠治疗后，其肺组织VEGF表达和MPO活性相对低于烫伤大鼠，同时肺微血管通透性降低，肺水肿减轻。说明丙戊酸钠通过抑制严重烫伤后VEGF的表达和中性粒细胞浸润，保护肺微血管内皮屏障，降低肺微血管通透性和肺水肿。

综上所述，本研究发现严重烫伤会导致肺微血管内皮屏障的损害，与前人研究类似。丙戊酸钠能够对抗此病理过程并保护肺微血管内皮屏障，从而改善烫伤后急性肺水肿等并发症，其作用机制可能与丙戊酸钠对VEGF和MPO的抑制作用有关。