植入式生物遥测技术在劳力型热射病大鼠实验模型中的应用

毛汉丁，王 娇，王宇曦，刘树元，邢 令，赵金宝，李 鑫，江利亚，苑晓燕，张玉想，宋 青解放军医学院，北京 008；解放军总医院第一医学中心 重症医学科，北京 008；解放军总医院第八医学中心 重症医学科，北京 0009；解放军总医院第六医学中心 急诊科，北京 0008；北京同仁医院 急诊科，北京 000；解放军总医院第三医学中心 急诊科，北京 0009；解放军疾病预防控制中心，北京 000

热射病是最严重的中暑类型[1-2]。根据致热因素的不同，热射病可分为“劳力型”和“经典型”(非劳力型)。其中，劳力型热射病(exertional heat stroke，EHS)的主要致热因素为运动或劳作产生的内源性热[1]。随着全球气候持续变暖，EHS的发病率和病死率逐年攀升，极大威胁着人们的生活、生产和生命[3]。通过建立EHS实验动物模型，可以进一步挖掘EHS的病理生理学变化机制，为未来治疗技术和预防策略的研究提供平台，并对技术标准进行临床前探索和评价。但遗憾的是，目前尚无成熟的EHS实验动物模型建模方法和标准，这使得不同研究中心的结论可能存在差异，为EHS的科学研究带来一定困难。本实验将生物遥测技术应用于EHS大鼠模型，有助于在EHS建模过程中实时、连续地监测大鼠的生命体征，大鼠在热暴露期间无需麻醉，保持自主的行为能力和热反应机制，以最大限度地减少外界干扰。我们期望通过研究方法的改进，进一步提升EHS实验模型的稳定性和分析能力，阐明高温和运动下EHS大鼠的病理生理变化规律，为今后EHS领域的深入研究打下基础。

材料与方法

1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠18只，体质量250～300 g，购于北京科宇动物养殖中心(动物生产许可证号：SCXK〔京〕2018-0010)，饲养于解放军疾病预防控制中心实验动物中心(SPF级)，室温22℃～24℃，相对湿度40%～70%，实验方案经解放军总医院第八医学中心医学伦 理委员会批准。

2 主要仪器和设备 小动物跑台(型号XR-PT-10A，上海欣软)被放置于一个透明高温高湿环境模拟舱(长 × 宽 × 高=1.1 m × 0.8 m × 1.1 m)内[4]，该舱可实现温湿度的精确控制并维持恒定。植入式生物遥测系统(美国 Data Sciences International公司)，由4部分组成：1)无线植入子(型号HDS10)，重量约4.4 g，体积约3.1 cm3，可同时监测血压(blood pressure，BP；± 3 mmHg)、心率(heart rate，HR)、核心温度(core temperature，Tc；± 0.1℃)，最短测量间隔为5 s，采集到的信号通过无线电发出；2)接收器，接收植入子发出的信号；3)信号转换模块，将模拟频率信号转换为数字信号输入计算机；4)计算机信号采集分析软件(Ponemah v5.20-SP8)。小动物保温手术台、动物麻醉机(型号 CDS9000，美国SurgiVet公司)及无菌手术器械。

3 大 鼠 腹 腔 植 入 术 在 热 射 病 建 模2周 前，18只大鼠进行遥测植入子腹腔植入术。大鼠手术前禁食12 h，饮水不限。术前30 min内称重，异氟醚麻醉，监测直肠温度并维持于36℃～38℃。腹部备皮、消毒、铺无菌洞巾，前正中线切口。术中将肠道用湿纱布覆盖并推至上腹部，小心打开后腹膜并游离腹主动脉，在穿刺口近、远端分别用丝线穿入动脉下间隙，用于临时阻断动脉。将10 mL注射器针头弯折90°，助手提起预置丝线临时阻断血管，用弯折过的针头刺破动脉壁，血压探头导管迅速置入腹主动脉，并立即用生物胶粘合止血固定，松开阻断线，将后腹膜和肠道复位，植入子缝合于腹膜下固定(图1)。术后每日检视伤口情况并消毒，监测生命体征和体质量变化。恢复1周，恢复期内单独饲养，大鼠可自由获 取食物和水。

图1 大鼠遥测植入子腹腔植入术示意图(1：近端阻断线；2：腹主动脉；3：远端阻断线；4：髂动脉；5：植入子及其压力导管)Fig.1 Schematic diagram of intraperitoneal radiotelemetry transmitter implantation in rats (1: proximal aorta occlusion;2: abdominal aorta; 3: distal aorta occlusion; 4: iliac artery;5: transmitter and its pressure catheter)

4 适应性训练 适应性训练在室温下进行，采用阶梯式锻炼法。术后第2周(热应激实验前1周)的前3 d以如下程序进行锻炼：大鼠从饲养笼转移进舱内先进行10 min环境适应——10 min后以5 m/min起始速度跑步(坡度为0°)——每2 min增速1 m/min——直至15 m/min后持续10 min或大鼠出现疲劳状态(经噪声、轻推等无痛刺激仍不

能坚持跑步＞5 s)，跑步时间不超过30 min。4 ~ 5 d，增速方案同前，跑步时间上限延长为1 h(超过1 h后大鼠爪趾受伤出血发生率增加)。6 ~ 7 d为休息日，仅进行舱内环境适应，不进行跑步锻炼。当大鼠拒跑时采用声音(敲击舱壁)等无痛刺激驱赶，程序中不使用电击或其他任何疼痛刺激来保持 大鼠跑步速度。

5 建立劳力型热射病模型 1)分组：在热应激实验前1 d，将成功建立遥测模型的6只大鼠随机分为劳力型热射病组(EH组，n=4)和非劳力型热射病组(单纯受热对照组，PH组，n=2)。2)热应激方案：大鼠热应激实验前禁食12 h，饮水不限，EH建模前30 min内称重并禁水(操作前先刺激大鼠排便)。大鼠热应激实验时，实验舱的环境温度(ambient temperature，Ta)设 置 为(39.5 ± 0.3)℃，相对湿度为55% ± 5%[5-7]。EH组大鼠以5 m/min起始速度跑步(坡度为0°)——每2 min增速1 m/min——速度达到15 m/min后持续，当大鼠出现疲劳状态后停止跑步程序，大鼠继续受热，直至目标终点，即出现热射病重度意识障碍表现(深昏迷，正位反射消失，疼痛刺激无任何动作反应)。实验中持续监测并记录大鼠Tc、BP、HR、神志表现变化。达到上述目标后立即将大鼠移出实验舱，停止热暴露，称重，室温(22℃～24℃)下自然降温，继续监测大鼠生命体征变化直至建模后24 h或大鼠死亡。大鼠恢复清醒后可自由接触食物和水。PH组大鼠入舱后接受与EH组同样的环境温度，但不进行跑步程序；热暴露100 min后将舱温提升2℃(Ta=41.5℃)，加速热应激 过程，直至目标终点。

6 记录与分析 大鼠Tc、BP、HR由生物遥测系统连续监测，每5 s记录1次(为了排除瞬间极值对以上指标的影响，制图和分析时取每连续30 s读数的平均值)。平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)由计算机自动分析得出，呼吸频率(respiratory rate，RR)由人工记录(出舱后开始记录)，每2 min记录1次。计算大鼠结束热暴露后15 min内的体温变化速率(℃/min)，受热前后体质量变化(%)。实验全程严密观察大鼠的神志和行 为变化，记录生存时间。

7 病理学检查 即刻解剖死亡EH大鼠，观察大体病理学变化，取大鼠肠、肝、肺、肾组织10%甲醛固定，石蜡包埋、切片后HE染色观察光镜下损伤改变。肾另作过碘酸雪夫氏染色(periodic a cid-Schiff's stain，PAS染色)，光镜下观察。

结 果

1 大鼠遥测模型的制备情况 在18只进行植入子手术的大鼠中，11只大鼠在术中(6只)或术后1周内(5只)死亡，死亡原因主要有失血过多(4只，22.2%)、麻醉意外(4只，22.2%)、术后不明原因低体温(1只，5.6%)、输尿管损伤(1只，5.6%)、其他不明原因(1只，5.6%)；其他术后并发症包括因腹主动脉阻断时间过长导致术后双下肢瘫痪(3只，16.7%)，其中1只术后1周内完全康复，另2只因术中失血过多在术后2 d内死亡；术后伤口不愈合(1只，5.6%)，清创后再次手术缝合，1周内康复。7只大鼠术后恢复良好，1周内恢复术前体质量，手术总体成功率38.9%(图2)。由于1只成功手术大鼠使用练习用假植入子，无遥 测功能，因此共成功制备6只遥测模型大鼠。

图2 植入子手术大鼠死亡原因及手术成功率Fig.2 Causes of death in rats received intraperitoneal transmitter implantation and the success rate of surgery

2 热应激实验中大鼠核心温度、血压、心率变化 1)核心温度变化：热应激初始时，大鼠的Tc几乎呈直线快速上升，EH组大鼠Tc上升速率明显快于PH组大鼠；当Tc超过Ta，EH组Tc上升速率仍基本不变，而PH组大鼠的Tc逐渐进入“平台期”；EH组大鼠停止跑步后，Tc上升速率变缓。当Ta=39.5℃时，PH组大鼠Tc较长时间保持稳定，神经运动功能保持正常；Ta升高为41.5℃后，大鼠Tc逐渐上升，神经功能表现逐渐恶化并达到目标终点。出舱后，PH组大鼠均在死亡前恢复正常Tc(38.5℃以下)；而 EH 组大鼠降温速率缓慢，75%(3只，n=4)大鼠死亡前Tc仍高于40℃。2)血压变化：开始热暴露后，大鼠MAP 呈“S”形升高，然后进入第1个平台期(兴奋期)，期间出现血压峰值；PH组大鼠MAP在进入平台期后长时间保持稳定，直至升高Ta后MAP逐渐升高至峰值。随着大鼠Tc的继续升高并接近一定阈值(不同大鼠差异明显)，MAP逐渐加速回落。大鼠出现重度意识障碍的同时，MAP急剧下降且收缩压 ≤90 mmHg。出舱后MAP以较低水平进入第2个平台期(休克期)，直至大鼠死亡前再次急剧下降。3)心率变化：入舱后，大鼠HR呈波动上升，与MAP同步到达峰值；此后HR先于MAP出现明显下降，并在出舱后进入谷底。随着MAP下降至“第2平台期”，HR回升并出现“第2波峰”，之后迅速下降，直至死亡。PH大鼠入舱后HR波动幅度增大，但基线平稳；Ta升高为41.5℃后，HR逐渐达到峰值，之后变化与EH大鼠相似。见图3、表1。

3 其他生理参数变化 大鼠出实验舱后RR快速回落，休克期内RR相对平稳，直至大鼠死亡前RR再次迅速下降呈“深大呼吸”。EH组和PH组大鼠EHS建模后丢失体质量占比均大于5%，提示中度脱水。全部6只EHS大鼠均在出舱后较短时间内(6.0～55.9 min)死亡，EH组大鼠平均生存时间为(19.98 ± 9.81) min，PH组大鼠平均生存时间为(47.13 ± 12.44) min。(图3，表1，由于本实验样本量较少，实验结果以定性分析为主，未进行统 计学组间比较)。

表1 热射病大鼠遥测模型生理参数汇总表Tab. 1 Physiological parameters of the EHS rats in biotelemetry model

图3 热应激实验中大鼠生命体征变化曲线A：EH大鼠；B：PH大鼠。HR：心率；MAP：平均动脉压；Ta：环境温度；Tc：核心温度；RR：呼吸频率；该型号植入子不支持呼吸监测，因此呼吸频率仅在出舱后进行人工记录Fig.3 Vital sign curves of rats during heat stress A: EH rats; B: PH rats. HR: heart rate; MAP: mean arterial pressure; Ta: ambient temperature; Tc: core temperature;RR: respiratory rate; Respiration cannot be measured by this model of implant, so respiratory rate was measured manually after heating

4 热射病大鼠多器官损伤病理表现 热射病建模大鼠出现多器官损伤。1)肠损伤：可见肠腔明显扩张，肠壁水肿，肠系膜血管扩张淤血，部分肠壁出现节段性缺血梗死。镜下见回肠绒毛结构破坏严重，肠腺减少，黏膜层厚度变薄，上皮层细胞变性坏死，部分脱落、呈自溶性改变；绒毛间质肿胀，大量炎症细胞(淋巴细胞、巨噬细胞)浸润，毛细血管及黏膜下层小血管扩张、充血；严重者出现节段性肠壁坏死，局部黏膜结构消失。2)肺损伤：大体病理见肺叶弥漫性肿胀，多发片状出血。镜下见肺泡间隔增厚、水肿，大量巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，肺泡壁血管扩张充血；严重者可见透明膜形成。3)肝损伤：大体下可见肝表面斑片状淤血。镜下肝细胞体积增大，肝血窦变窄，内可见炎症细胞浸润、淤血，部分肝细胞脂肪变，即胞质内出现大小不等的张力性空泡。4)肾损伤：大体可见双肾形态饱满，略微肿胀。镜下呈急性肾小管损伤表现，可见肾小管扩张，部分近曲小管上皮细胞坏死脱落，PAS染色显示刷状缘消失，顶端突起、胞质出泡；严重者可见肾小球和肾小管间质内毛细血管充血，微血栓形成，部分肾小管上皮完全脱落至管腔，形成细胞和颗粒管型，基底膜裸露。EH大鼠建模30 min后肠、肺、肝、肾损伤病理表现见图4。

图4 EH大鼠多器官(肠、肺、肝、肾)损伤病理表现(绿箭头：肝中央静脉；黄箭头：肾小球；黑箭头：上皮细胞损伤、炎症细胞浸润；蓝箭头：毛细血管扩张充血、血栓、或出血)A～C：肠、肺、肝大体病理图；D：肾PAS染色光镜下(200 ×)；E～H：HE染色光镜下(100 ×)Fig.4 Pathological manifestations of multiple organ injuries (intestine, lung, liver, kidney) in EH rats (green arrow: hepatic central vein;yellow arrows: glomeruli; black arrows: epithelial cells injury and inflammatory cells infiltration; blue arrows: capillary dilation,congestion, thrombi, or hemorrhage)A-C: Gross pathological images of intestine, lung, and liver; D: PAS staining of kidney, 200 × under a light microscope; E-H: H&E staining, 100 × under a light microscope

讨 论

目前，建立EHS实验动物模型的瓶颈主要存在于3个方面：1)如何模拟高热环境；2)如何选择热应激目标终点(即EHS诊断标准)；3)如何判断动物何时达到了目标终点。其中后两者密切相关。大多数研究者常以Tc、BP等重要生命体征达到某一预设阈值的时刻作为动物发生热射病的起始[5,7-11]。而如何监测连续运动的清醒动物生命体征则成为一个重要的技术难点。传统的监测方法往往不能在动物清醒状态下使用(如股动脉置管监测动脉血压)，或必须限制/中断动物的自由活动(如测量直肠温度)，这些不足限制了EHS模型的使用，因为该模型必须保证动物能够在清醒状态下不受干扰地活动。

生物遥测技术是一种重要的生物信号远距离监测方法，可通过电磁波、光或超声波等各种能量形式将获取的数据(生物环境、生理、生化和行为活动等参数)无线传送至远离受测对象的计算机数据采集系统[12]。根据是否需要通过有创方式植入传感器，生物遥测技术可分为植入式和非植入式。在近年来的生物医学研究中，植入式生物遥测技术的应用显著增加，特别是在药理学和毒理学研究领域[13]。相较于传统的监测技术，已有充分的证据验证了植入式生物遥测技术测量生物信号的可靠性和优势：1)可建立清醒实验动物模型，且无需限制动物自由活动，避免麻醉或束缚带来的干扰；2)连续、实时获取并记录各项指标，在测量时无需对动物进行任何特殊的操作或照料，免除一些侵入式测量方法带来的痛苦；3)所得数据真实可靠，增强了研究的稳定性，有助于减少实验动物用量，提高实验动物福利[13-14]；4)植入子手术对动物身体生长、昼夜节律和运动活动的影响可在14 d内恢复[15]。

Leon等[15]最早将植入式生物遥测技术应用于经典型热射病小鼠模型中的Tc监测(未实现BP、HR的监测)。由于无需麻醉，实验动物的活动和体温调节机制可不受干扰或限制；相比测量直肠温度，植入式生物遥测技术的测量结果更加可靠(直肠温度常受探头插入深度和肠内容物导热性的影响)且可减少动物的不适。受益于此，EHS实验动物模型得到进一步发展[6-7,16]。

在此基础上，我们在实验中将同时具备温度和血压监测功能的植入式生物遥测技术应用于大鼠的EHS模型中，实现了动物在清醒运动的状态下对Tc、BP及HR的同步实时监测，利用现有的热射病实验动物标准，成功建立EHS大鼠实验模型，并观察大鼠生命体征在热应激下的变化规律。

对于初学者来说，应用植入式生物遥测技术的最大难点在于植入子手术的实施，尤其是包含血流、心电监测功能的植入子手术。手术相关的并发症包括大量失血导致的休克、低体温、腹腔或伤口感染、下肢瘫痪、泌尿系损伤和麻醉意外，其中导致手术失败的最主要原因是失血过多和麻醉意外。但随着对该技术的熟练掌握和团队配合的日渐默契，这些并发症可以避免。我们实验中出现的失败案例均发生于该系列实验的早期，其他研究中同类手术的成功率可达90%以上[13]。相对来说，进行单一温度传感器植入手术难度小，成功率更高，术后并发症少，目前国内已有单位开展[10]。虽然植入子可以重复利用，但相对有限的植入子数量限制了同批进行动物实验的样本量；另外，至少1周的术后恢复期将延长实验的整体周期。以上因素一定程度上增加了实验的经济和时间成本，限制了该技术在EHS模型中的广泛应用。相信随着遥测技术的发展，监测设备将进一步微型化、种类多样化，成本也有望进一步降低。

也有学者认为，Tc或其他生命体征参数并不是EHS临床诊断或动物建模标准最理想的指标[17-18]。相较而言，中枢神经系统功能损伤表现以及多器官损伤证据被认为可真实、可靠地反映热射病的病情程度[18-20]。因此，基于中枢神经系统损害程度的EHS大鼠建模标准可能是未来EHS实验动物研究的新方向[16,21]。

综上，本实验将植入式生物遥测技术应用于EHS 大鼠模型的制备过程中，完整记录了热应激下清醒运动大鼠的关键生理参数变化过程。该模型的建立，有助于进一步挖掘EHS的病理生理学变化特点和机制，为后续EHS关键干预技术的研究提供必要工具。