探讨Rab27蛋白家族在三阴性乳腺癌细胞耐药机制中的作用

王 丽，严志锐，黄丹菊，夏耀雄

昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院 放射治疗科，云南昆明 650118

乳腺癌为女性癌症死亡的第一大原因[1]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)约占所有乳腺癌发病率的15%[2]。由于分子表达模式的原因，TNBC不能用激素或Her-2靶向治疗，目前化疗和免疫治疗是唯一可用的全身治疗策略。但并非所有患者都能从化疗中获益[3]。多药耐药(multi-drug resistance，MDR)的出现是化疗失败的主要原因。有研究发现乳腺癌细胞可以通过外泌体将化疗药物阿霉素排出到细胞外培养基[4]。还有大量研究表明，膜转运蛋白ABC超家族编码的重要药物转运体P-gp蛋白可通过外泌体从肿瘤耐药细胞转移到敏感细胞，导致敏感细胞获得性耐药[5-6]。外泌体还能通过介导某些功能蛋白或miRNA的转移对细胞耐药进行间接调控[7]；转移耐药细胞的某些促细胞增殖、迁移和抗凋亡的信号分子至受体细胞[8-9]；转移药物代谢酶诱导药物失活[10]。众所周知，Rab家族控制了几乎所有的膜转运过程，包括囊泡出芽、外泌体释放以及与受体膜的对接和融合[11]。其中，Rab27家族与外泌体的释放密切相关，包括Rab27a和Rab27b这两个不同的分子[12]。已有研究表明Rab27a和Rab27b能够控制包括乳腺癌细胞在内的多种不同类型肿瘤细胞的外泌体分泌[13-14]。但另外一项对乳腺癌细胞4T1和TS/A的研究表明，Rab27a才是外泌体分泌所必需的，而非Rab27b[15]。本研究通过靶向与外泌体分泌密切相关的Rab27家族，探究该家族在三阴性乳腺癌细胞MDR过程中的具体作用，期望为因MDR导致化疗失败的TNBC患者提供可能的分子治疗方案。

材料与方法

1 主要试剂与仪器 三阴性乳腺癌细胞系MDAMB-231购自中国科学院昆明动物所细胞库；DMEM高糖培养基、外泌体去除胎牛血清(fetal calf serum，FBS)购自美国Gibco公司；外泌体提取试剂盒购自美国Life公司；脂质体转染试剂、Opti-MEM培养基以及本研究中用到的siRNA均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量分析试剂盒购自ABI公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司；Rab27A、Rab27B、CD9、MHCⅡ和GAPDH蛋白抗体均购自美国Abcam公司；顺铂、阿霉素和紫杉醇均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；荧光定量PCR仪(ABI)；全自动酶标仪(TECAN)；光学显微镜(奥林巴斯)；二氧化碳细胞培养箱(Thermo热电)；NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo热电)；流 式细胞仪(BD)。

2 细胞培养及外泌体的提取 MDA-MB-231细胞使用含10% FBS、1%双抗的DMEM高糖培养基置于37℃、5% CO2条件的恒温培养箱中培养，每2 d换液。收取对数生长期细胞生长状态良好、汇合程度达到70% ～80%时的细胞上清液，采用外泌体提取试剂盒分离提取外泌体，随后使用NanoDrop测定外泌体蛋白质浓度后进行后续实验。如果无法立即进行后续实验，提取出的外泌体 重悬在PBS缓冲液中，保存于-80℃冰箱。

3 Rab27a和Rab27b siRNA转染 按照Lipofectamine RNAi-MAX转染试剂盒说明书，添加10 nmol/L siRNA转染细胞，24 h后收集细胞检测干扰效率。关于siRNA的详细信息可通过ID号登陆https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html搜索查询，Rab27A siRNA ID号为HSS108985，Rab27B siRNA的ID号为HSS184177，阴性对照N C siRNA的ID号为D-001810-10。

4 Western blot检测Rab27家族蛋白的表达以及外泌体分泌的定量 使用RIPA裂解液提取细胞和组织中的总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测所得总蛋白浓度后，取等量总蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳分离不同大小蛋白，随后将目的蛋白采用半干转膜法转移到PVDF膜上，一抗标记目的蛋白，二抗与一抗结合显色，洗净后用化学发光成像仪检测蛋白条带，以条带的深浅反映Rab27a和Rab27b蛋白表达量的变化。外泌体分泌的定量方法与上述方法基本一致，样本使用提取出的外泌体，最后通过用图像分析软件Image J对外泌体标志蛋白CD9和MHC Ⅱ及内参蛋白(GAPDH)条带进行灰度值测试，以CD9和MHCⅡ /内参灰度值比值表示外泌体的相对分泌量。

5 CCK-8检测不同浓度药物处理细胞增殖情况 待转染后的各组细胞生长到对数期并且汇合程度达到70% ～80%时，消化重悬细胞并进行细胞计数后，每组设5复孔，共设18个不同药物浓度处理组和1个不含药物的完全培养基对照组，按104/孔的细胞密度重悬细胞铺板于96孔板内，培养24 h后按CCK-8试剂盒说明书加入CCK-8试剂孵育细胞，随后直接使用酶标仪检测OD450的数值表示各组细胞的增殖情况。18个不同药物浓度处理组的设置：分别含0.03 µg/mL、0.3 µg/mL、3 µg/mL、7.5 µg/mL、15 µg/mL和30 µg/mL顺铂的完全培养基6组；分别含0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2.5 µg/mL、10 µg/mL和25 µg/mL阿霉素的完全培养基6组；以及分别含2.67 µg/L、5.34 µg/L、10.67 µg/L、21.35 µg/L、42.70 µg/L和8 5.39 µg/L紫杉醇的完全培养基6组。

6 流式细胞术检测细胞凋亡率 待转染后的各组细胞生长到对数期并且汇合程度达到70% ～80%时，消化重悬细胞并进行细胞计数后，每组设3复孔，分别用含7.5 µg/mL顺铂、2.5 µg/mL阿霉素、10.67 µg/L紫杉醇的完全培养基，以及不含药物的完全培养基，按105/孔的细胞密度重悬细胞铺板于6孔板内，每组设3复孔，培养24 h后按照细胞凋亡与坏死试剂盒说明书收集细胞染色孵育，随后使用流式细胞仪检测处理好的细胞，以处于特定象限内的细胞比率表示各组细胞的凋亡 率。

7 qPCR检测耐药相关基因的表达 Trizol法提取细胞中的总RNA，参照ABI High capacity cDNA reverse transcription反转录试剂盒进行cDNA的合成。以反转录得到的cDNA为模板，按照ABI公司的荧光定量分析试剂盒(SYBR Select Master Mix)进行实时荧光定量PCR反应。反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 10 µL，上、下游引物各1 µL，cDNA模板2 µL，RNase-free water 6 µL，总体积20 µL。反应结束后，以GAPDH为内参使用2-ΔΔCt法分别计算IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6基因 mRNA 相对表达量。内参基因G APDH和其他4个基因的引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR所用引物Tab. 1 Real-time quantity of PCR primers

8 统计学方法 数据用统计软件SPSS22.0进行分析。计量数据(均为正态或轻微偏态)以± s表示，两组间的差异采用独立样本t检验进行分析。结果用软件Graphpad Prism 6作图。P＜ 0.05为差异有统计意义。

结 果

1 抑制Rab27家族对MDA-MB-231细胞外泌体分泌的影响 荧光定量PCR和Western blot检测siRNA干预细胞24 h后，结果显示siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b序列在基因(图1A)和蛋白(图1B)表达水平上均能够有效抑制Rab27a和Rab27b表达。随后对外泌体含量进行分析，发现抑制Rab27a表达后，MDA-MB-231细胞的外泌体分泌量与对照组、siRNA-RAB27b组比较均降低(P＜ 0.05)；但抑制Rab27b表达后，MDA-MB-231细胞外泌体分泌量与对照组相比差异不大，CD9的相对表达量差异无统计学意义(P＞ 0.05)，MHC Ⅱ的相对表达量降低(P＜ 0.05)。提示siRNA-RAB27a有效抑制了MDA-MB-231细胞的外泌体分泌，而siRNA-RAB27b对MDA-MB-231细胞的外泌体分泌虽然有抑制作用，但作用较小。见图2。

图1 siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b转染MDA-MB-231细胞后对Rab27a和Rab27b基因和蛋白表达的影响(aP ＜ 0.05，vs对照组)A：转染siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b后对MDA-MB-231细胞Rab27a和Rab27b蛋白表达的影响(n=6)；B：转染siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b后对MDA-MB-231细胞Rab27a和Rab27b基因mRNA表达的影响(n=9)Fig.1 Effects of siRNA-RAB27a and siRNA-RAB27b on the expression level of Rab27a and Rab27b genes and proteins after transfection of MDA-MB-231 cells (bP ＜ 0.05, vs control)A: Effects of transfection of siRNA-RAB27a and siRNARAB27b on the protein expression of Rab27a and Rab27b in MDA-MB-231 cells (n=6); B: Effects of transfection of siRNA-RAB27a and siRNA-RAB27b on the mRNA expression of Rab27a and Rab27b genes in MDA-MB-231 cells(n=9)

图2 抑制Rab27a和Rab27b表达后对MDA-MB-231细胞外泌体分泌量的影响(aP ＜ 0.05，vs对照组；bP ＜ 0.05，vs si-RAB27a组。n=6)Fig.2 Effect of inhibiting Rab27a and Rab27b expression on exosome secretion of MDA-MB-231 cells (aP ＜ 0.05, vs EXOControl;bP ＜ 0.05, vs EXOsi-RAB27a. n=6)

2 抑制Rab27家族对MDA-MB-231细胞耐药的影响 分别用不同浓度的顺铂、阿霉素和紫杉醇处理MDA-MB-231细胞并分别抑制Rab27a和Rab27b的MDA-MB-231细胞48 h后，用CCK-8法检测细胞的生长情况，发现药物浓度为0时，抑制Rab27a后MDA-MB-231细胞增殖能力会受到一定影响，而抑制Rab27b对细胞增殖能力无影响。随着三组药物浓度的升高，可以看出Rab27b被抑制后的MDA-MB-231细胞对药物更加敏感，而抑制Rab27a后的MDA-MB-231细胞增殖情况受到药物浓度升高的影响，但影响程度小于抑制Rab27b组。尤其在三组药物的最高浓度组可以明显看到，抑制Rab27b组的细胞受药物干预后的增殖能力低于抑制Rab27a组，说明抑制Rab27家族使三阴性乳腺癌细胞对顺铂、阿霉素和紫杉醇的药物耐受程度降低，并且抑制Rab27b对三阴性乳腺癌细胞药物耐受程度的降低作用强于抑制Rab27a。见图3。

图3 抑制Rab27a和Rab27b表达后对MDA-MB-231细胞耐药的影响(n=9)A：抑制Rab27a和Rab27b表达后对MDA-MB-231细胞在不同浓度顺铂处理下细胞增殖能力的影响；B：抑制Rab27a和Rab27b表达后对MDA-MB-231细胞在不同浓度阿霉素处理下细胞增殖能力的影响；C：抑制Rab27a和Rab27b表达后对MDA-MB-231细胞在不同浓度紫杉醇处理下细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of inhibition of Rab27a and Rab27b expression on drug resistance of MDA-MB-231cells (n=9)A: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of cisplatin; B: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of Dox; C: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of PTX

3 抑制Rab27家族对不同药物处理下MDA-MB-231细胞凋亡的影响 流式细胞术检测显示用顺铂处理的MDA-MB-231细胞抑制Rab27a和Rab27b后，与正常MDA-MB-231细胞相比，细胞凋亡率均显著上升(P＜ 0.05)，抑制Rab27b组的细胞凋亡率显著高于抑制Rab27a组(P＜ 0.05)。使用阿霉素处理细胞后的结果与顺铂类似，抑制Rab27a组和抑制Rab27b组的细胞凋亡率均显著高于对照组(P＜ 0.05)，并且抑制Rab27b组的细胞凋亡率同样显著高于抑制Rab27a组(P＜ 0.05)。紫杉醇处理细胞后，虽然抑制Rab27a组和抑制Rab27b组的细胞凋亡率与顺铂和阿霉素类似，但抑制Rab27a组与抑制Rab27b组的细胞凋亡率无统计学差异(P＜0 .05)。见图4。

4 抑制Rab27家族对MDA-MB-231细胞耐药相关基因表达的影响 qPCR法检测MDA-MB-231细胞在Rab27a和Rab27b被抑制后的耐药相关基因IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6 mRNA表达量，发现si-NC组与对照组无统计学差异，但抑制Rab27家族后IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6 mRNA的表达量与对照组相比均显著下降(P＜0.05)。抑制Rab27b组IL-6基因的表达显著低于抑制Rab27a组(P＜ 0.05)，而EGR1基因的表达在两组间无统计学差异，ABCC3和ABCC6基因在抑制Rab27b组的表达量显著低于抑制R ab27a组(P＜ 0.05)。见图5。

图5 抑制RAB27家族表达对MDA-MB-231细胞耐药相关基因表达的影响(aP ＜ 0.05，vs对照组；bP ＜ 0.05，vs si-RAB27a组。n=9)Fig.5 Effect of inhibiting the expression of RAB27 family on gene expression related to drug resistance in triple negative breast cancer cells(aP ＜ 0.05, vs control; bP ＜ 0.05, vs si-RAB27a. n=9)

讨 论

TNBC 是预后最差的乳腺癌亚型， 目前手术、放疗和化疗相结合是治疗TNBC 的唯一手段。顺铂(诱导DNA 双链断裂)、阿霉素(DNA 破坏剂) 和紫杉醇(微管稳定药物) 等抗癌药物应用于包括TNBC 在内的癌症化疗治疗策略，然而治疗的有效性受到耐药的严重影响[16-18]。已有研究表明，耐药的癌细胞能够将化疗药物包裹在外泌体中，并将抗癌药物从肿瘤细胞中穿梭出来[19]。外泌体还能够将与肿瘤耐药性相关的microRNA、mRNA和蛋白质运送到癌细胞，由于外泌体在肿瘤微环境中被用作基因交换的载体，耐药肿瘤细胞会劫持这一机制，使敏感细胞产生耐药性[20]。在脊椎动物中，Rab27家族由Rab27a和Rab27b组成[21]。许多研究表明，Rab27a和Rab27b能够控制包括子宫颈癌细胞、乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞在内的多种不同类型癌细胞的外泌体分泌[12]。尽管Rab27a和Rab27b具有很高的序列相似性(71%的氨基酸序列同一性)并募集相同的效应蛋白，但之前的研究发现这两个Rab27亚型在不同类型的癌细胞中功能不同，即使在同一细胞类型中也发挥不同的作用[22]。

本研究采用siRNA分别干扰Rab27a和Rab27b在三阴性乳腺癌细胞株中的表达，发现抑制Rab27a表达后显著降低了三阴性乳腺癌细胞的外泌体分泌，而抑制Rab27b表达后三阴性乳腺癌细胞外泌体的分泌量没有受到太大的影响。进一步检测Rab27a和Rab27b抑制后三阴性乳腺癌细胞对顺铂、阿霉素和紫杉醇的耐受情况，发现抑制Rab27家族后三阴性乳腺癌细胞对顺铂、阿霉素和紫杉醇的药物耐受程度降低，抑制Rab27b的效果强于抑制Rab27a，并且在同浓度的顺铂和阿霉素处理条件下检测细胞凋亡率也发现了相同的情况。通过对耐药相关基因表达的检测也发现，抑制Rab27b组的IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6四个基因表达量均显著低于对照组(P＜ 0.05)，除EGR1外其他3个基因的表达量均显著低于抑制Rab27a组(P＜ 0.05)。有研究证实癌细胞活跃的外泌体分泌能够刺激IL-6基因表达量上调[23]。对紫杉醇耐药乳腺癌细胞株外泌体的microRNA分析表明，其中含有的microRNA能够调控EGR1基因的表达从而促进耐药的发展[24]。对肝癌细胞的耐药研究也发现Rab27b能够与耐药蛋白(ABC超家族编码的P-gp蛋白)相互作用提高肿瘤细胞的耐药性[25]。因此，我们推测Rab27a导致的三阴性乳腺癌细胞耐药增强可能是通过促进外泌体的分泌而促成，如通过外泌体直接转运出药物，或通过外泌体在癌细胞中传递耐药相关的某些功能蛋白、microRNA或mRNA。Rab27b导致的三阴性乳腺癌细胞耐药增强机制可能与Rab27a不同，其可能不直接影响三阴性乳腺癌细胞外泌体的分泌，但可能对其他耐药相关基因的表达起到重要的调控作用，具体的调控网络还需要进一步的研究来阐明。

综上所述，本研究使用siRNA抑制Rab27a和Rab27b后对三阴性乳腺癌细胞株中外泌体的分泌以及耐药情况进行分析，发现抑制Rab27a和Rab27b均能够降低三阴性乳腺癌细胞株耐药的发展，进一步分析发现这两个蛋白可能涉及不同的耐药机制，未来深入研究Rab27b背后的耐药调控网络对因MDR导致化疗失败的TNBC患者或许有更大的临床意义。

作者贡献：王丽完成本研究大部分的实验设计和实验内容；严志锐和黄丹菊协助完成部分实验以及数据收集与统计分析；夏耀雄在项目思路、实验设计以及文章撰写方面提出了许多指导性的意见和建议。全体作者都阅读并同意最终的文本。