微小RNA-21对急性肾损伤模型大鼠线粒体氧化磷酸化的影响及机制研究

张 星，高 明，赵 武，赵成群，康云慧，RASSUL(哈萨克斯坦)

(1.西安大兴医院肾内科，陕西 西安 710082；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)指由感染、肾实质或肾血管相关性疾病、尿道梗阻、药物等多种因素引起的短时间内肾功能急速下降的临床综合征[1]。若救治不及，可导致肾脏组织功能障碍，发展为慢性肾功能损伤甚至终末期肾病，严重威胁患者的身体健康和生活质量[2]。线粒体是一种广泛存在于各类细胞中的重要细胞器，是机体氧化磷酸化供能的主要场所[3]。肾脏是仅次于心脏的线粒体含量第二丰富的脏器。既往研究[4]表明，AKI可导致线粒体结构损伤，影响其氧化磷酸化功能，进而引起细胞损伤。微小RNA(microRNA，miR)是一类高度保守的内源性非编码RNA，是真核生物体内重要的基因表达调控分子，可通过干扰mRNA的翻译实现对靶基因表达的调控，在机体内细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[5]。已有研究[6-7]报道miR-21参与了多种心血管、肺脏、肝脏、免疫系统疾病以及恶性肿瘤的发生与发展，尤其在细胞损伤和凋亡过程中发挥重要作用。然而，miR-21是否参与了AKI病程，其具体分子机制如何，目前鲜有报道。因此，本研究通过分析miR-21对AKI模型大鼠肾脏组织线粒体氧化磷酸化功能的影响，探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：8周龄雄性SPF级SD大鼠40只，体重(180±10)g，由我院医学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(苏)2020-0906。常规饲养于恒温恒湿的洁净动物房内，正常昼夜交替，自由饮水、摄食。

1.1.2 主要试剂：脂多糖(LPS)(批号：L8880)购自北京Solarbio公司；抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)抗体(批号：kl337Ra21)购自美国KALANG公司；核呼吸因子1(NRF1)抗体(批号：ab268093)、线粒体转录因子A(TFAM)抗体(批号：18G102B2E11)购自英国Abcam公司；血清尿酸(SUA)、血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)(批号：TR24321、981956、TR12421)均购自美国Thermo Fisher公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(批号：C2003S)购自上海碧云天生物技术有限公司；三磷酸腺苷(ATP)含量试剂盒(批号：C0550)购自北京Solarbio公司。

1.1.3 主要仪器：超低温冰箱、酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；组织匀浆机购自美国Bio Spec公司；低温离心机购自美国Sigma公司；全自动生化分析仪购自美国Beckman Coulter公司；激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AKI大鼠模型建立及分组：将40只大鼠随机分为对照组、模型组、阴性对照组和miR-21抑制剂组，每组10只。首先，模型组、阴性对照组和miR-21抑制剂组均腹腔注射10 mg/kg的LPS溶液，对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。然后，阴性对照组腹腔注射转染阴性对照，miR-21组腹腔注射miR-21 antagomiR，两组均持续注射7 d；对照组和模型组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 大鼠SUA、Scr和BUN水平检测：各组大鼠禁食12 h后，眼眶取血4 ml，4000 r/min低温离心10 min分离血清，全自动生化分析仪检测其中SUA、Scr和BUN水平。

1.2.3 大鼠肾脏组织HE染色：取各组大鼠部分肾脏组织置于4%多聚甲醛溶液中脱水、包埋、切片，进行HE染色，光学显微镜下观察其病理学变化。

1.2.4 线粒体分离制备：取各组大鼠适量肾脏组织，分离除去肾筋膜、肾盂等部分，以冰冷的缓冲溶液(KCl 40 mmol/L，EGTA 2 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L，蔗糖 200 mmol/L，BSA 1 mg/ml)冲洗除去残余血液，将肾组织剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm的小碎片，置于组织匀浆机中匀浆。将所得匀浆液置于低温离心机中4000 r/min离心15 min。取上清，转移至预冷的EP管中，12000 r/min低温离心10 min。弃上清，所得沉淀即为线粒体。

1.2.5 线粒体功能测定：按照检测试剂盒(JC-1)说明书配置荧光染料，37 ℃下以300 nmol/L浓度的JC-1标记细胞，PBS漂洗2次，采用流式细胞仪测定其荧光强度。参照ATP荧光检测试剂盒说明书中的方法配置ATP检测工作液，将各组样品和工作液加入96孔板，采用BCA法测定各组蛋白浓度，计算各组样品中ATP浓度。ATP浓度与蛋白浓度比值即为ATP含量，以nmol/mg蛋白表示。

1.2.6 线粒体氧化磷酸化功能测定：将上述分离制备的线粒体置于1 ml缓冲液(KH2PO410 mmol/L，KCl 10 mmol/L，甘露醇300 mmol/L，MgCl25 mmol/L)、0.1% BSA溶液中，置于37 ℃水浴中重悬，保持线粒体浓度在0.5～1.2 mg/ml，以苹果酸10 mmol/L+谷氨酸20 mmol/L作为复合体Ⅰ的作用底物，以琥珀酸20 mmol/L+鱼藤酮7.5 μmol/L作为复合体Ⅱ的底物，以2，2，6，6-四甲基哌啶酮(TMPD)10 mmol/L作为复合体Ⅳ的底物，采用Clark氧电极法测定线粒体呼吸Ⅲ态(R3)、呼吸Ⅳ态(R4)、呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O)和2 mmol/L ADP刺激的呼吸率。 RCR=R3/R4，P/O=ADP量/R3耗氧量。

1.2.7 肾组织中miR-21、PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表达水平检测：用TRIzol试剂提取各组大鼠肾脏组织中的总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA文库，进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共45个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，计算各组大鼠肾组织中miR-21、PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA的相对表达量。各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.2.8 PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白相对表达量检测(Western blot)：取各组大鼠适量肾组织，用RIPA细胞裂解液裂解提取总蛋白，蛋白浓度测定用BCA法。分别取30 μg总蛋白电泳后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗后4 ℃孵育过夜。继续加入二抗孵育1 h，加入电化学发光液，应用Image Lab软件计算各蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠SUA、Scr和BUN水平比较 见表2。与对照组相比，模型组和阴性对照组大鼠SUA、Scr和BUN水平升高(均P<0.05)。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组大鼠SUA、Scr和BUN水平较低(均P<0.05)。

表2 各组大鼠SUA、Scr和BUN水平比较

2.2 各组大鼠肾脏组织HE染色结果比较 见图1。对照组肾脏组织结构清晰正常，肾小管上皮细胞排列整齐，偶尔可见少数坏死的上皮细胞，未见纤维增生。模型组和阴性对照组肾脏组织中均可见大量肾小管萎缩坏死和淋巴细胞浸润，腔内存在玻璃样管型，上皮细胞肿胀，肾间质纤维化。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组肾脏组织损伤明显减轻。

2.3 各组大鼠线粒体膜电位和ATP含量比较 见表3。与对照组相比，模型组和阴性对照组大鼠线粒体膜电位和ATP含量显著降低(均P<0.05)。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组大鼠线粒体膜电位和ATP含量较高(均P<0.05)。

表3 各组大鼠线粒体膜电位和ATP含量比较

2.4 各组大鼠线粒体氧化磷酸化功能指标比较 见表4。与对照组相比，模型组和阴性对照组以苹果酸+谷氨酸、琥珀酸及TMPD为底物的R3、RCR、ADP较低，而R4、P/O较高(均P<0.05)，说明线粒体呼吸功能受到显著抑制。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组R3、RCR、ADP显著增加，而R4、P/O显著降低(均P<0.05)。

表4 各组大鼠线粒体氧化磷酸化功能指标比较

2.5 各组大鼠肾脏组织miR-21表达水平比较 见图2。与对照组相比，模型组和阴性对照组大鼠肾脏组织miR-21表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组大鼠肾脏组织miR-21表达水平较低(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组和阴性对照组比较，#P<0.05

2.6 各组大鼠PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA相对表达量比较 见表5。与对照组相比，模型组和阴性对照组PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA相对表达量较低(均P<0.05)。与模型组和阴性对照组相比，miR-21抑制剂组PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA相对表达量较高(均P<0.05)。

表5 各组大鼠PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA相对表达量比较

2.7 各组大鼠PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白相对表达量比较 见图3。与对照组相比，模型组和阴性对照组PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白相对表达量显著降低(均P<0.05)。抑制miR-21后，PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白相对表达量显著升高(均P<0.05)。

注：左图为各蛋白电泳图。右图中，与对照组比较，*P<0.05；与模型组和阴性对照组比较，#P<0.05

3 讨 论

线粒体是细胞氧化磷酸化的主要场所，是机体内能量的主要来源，一旦受损便可导致ATP合成障碍，进而引起细胞损伤和凋亡[8]。miRNA是一类在进化上高度保守的内源性单链非编码RNA，是真核生物体内重要的基因表达调控分子，可与靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)相结合，沉默靶基因，从而影响其翻译过程，进而抑制蛋白表达，对细胞增殖、凋亡及线粒体功能产生影响[9]。miR-21为其中一种广泛存在于机体各组织器官中的miRNA，且靶基因众多。研究[10-13]表明，miR-21与高氧性急性肺损伤(HALI)、心肌细胞缺血再灌注损伤、肾缺血再灌注损伤以及肿瘤发生与发展等密切相关。

本研究通过腹腔注射LPS建立AKI模型，发现模型组和阴性对照组大鼠肾脏组织中miR-21表达水平较对照组显著上调，提示miR-21可能参与了LPS诱导的肾损伤进程。随后的肾功能指标检测结果显示，与对照组相比，模型组和阴性对照组大鼠SUA、Scr和BUN水平均显著升高，而miR-21抑制剂组大鼠SUA、Scr和BUN水平则显著低于模型组和阴性对照组。

线粒体膜的完整性是保证线粒体功能以及氧化磷酸化的前提。线粒体膜电位可反映电子链传递的质子梯度，ATP合成酶则可利用该梯度合成ATP[14]。当线粒体受损时，线粒体膜上孔道开放，通透性增加，膜电位即会下降甚至消失，而ATP合成亦会受阻，进而引起细胞损伤[15]。本研究中，模型组和阴性对照组线粒体膜电位和ATP含量较对照组均显著降低，而抑制miR-21后线粒体膜电位和ATP含量均有所上升，提示抑制miR-21可对线粒体功能发挥保护作用。

线粒体呼吸链的氧化磷酸化过程即为底物的电子经一系列酶系传递，最终生成ATP供能的过程，而氧化磷酸化的解耦连则可导致ATP供能不足，从而引起细胞凋亡[16]。本研究发现，模型组和阴性对照组以苹果酸+谷氨酸和琥珀酸为底物的两条呼吸链受抑制，而miR-21抑制剂组的呼吸功能得以显著改善，提示抑制miR-21可保护线粒体的氧化磷酸化功能。

线粒体的呼吸功能和氧化磷酸化过程受多种基因调控，其中PGC-1α、NRF1和TFAM为关键的调控因子。PGC-1α为肾脏组织中氧化磷酸化、三羧酸循环以及脂肪酸氧化的主要转录因子之一，可影响线粒体的生物合成、功能和有氧呼吸，并辅助活化NFR1和NFR2，提高线粒体生成、细胞呼吸率以及对能量底物的摄取和利用，以满足细胞在环境变化时能量需求的变化[17]。Tran等[18]发现AKI模型小鼠肾功能与PGC-1α表达呈正相关，而敲除PGC-1α基因后小鼠肾脏缺血耐受力明显减弱，肾损伤则加重。NRF1可调节核基因组编码的呼吸链亚基的表达，亦可通过TFAM调控途径而影响线粒体基因组的转录和翻译等[19]。TFAM可通过调节线粒体DNA(mtDNA)轻链和重链的转录，从而调控mtDNA转录和复制。总之，PGC-1α可通过强烈诱导NRF1并结合NRF1共同作用于TFAM启动子区域，参与调节线粒体基因组转录与复制。向飞等[20]研究发现，SO2和BaP的复合暴露可通过下调PGC-1α、NRF1和mtTFA基因表达而诱导小鼠心肌细胞线粒体损伤。本研究通过RT-PCR和Westren blot技术分别检测了调控基因PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA和蛋白的表达，结果显示模型组和阴性对照组PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA和蛋白相对表达量均显著降低，而抑制miR-21后均显著升高，提示miR-21调控了PGC-1α、NRF1和TFAM基因的表达。

综上所述，miR-21可通过调控线粒体氧化磷酸化的关键基因PGC-1α、NRF1和TFAM的表达，破坏线粒体氧化磷酸化，诱发大鼠肾损伤。抑制miR-21表达可以对线粒体氧化磷酸化功能及肾组织损伤起到保护作用。miR-21有望成为临床治疗AKI的新型靶点之一。