微小RNA-141和Yes相关蛋白1在胃癌组织中的表达及其对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

张 俊，张丽秋，姜登鸽，杨彩丰，赵 鹏，朱玉侠，马文兵

(1.西安市第一医院消化内科，陕西 西安 710002；2.西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西 西安 710061)

胃癌是目前全球发病率较高的恶性肿瘤之一[1]，其发病率常年位居恶性肿瘤发病率前列，且由于早期胃癌临床症状并不明显，患者接受治疗时多已处于中晚期，因而预后较差[2-3]。数据显示，我国胃癌病死例数约占全球胃癌病死总数的40%[4]，即使患者接受了根治性手术及放化疗干预，5年生存率仍然仅为35%～40%[5]。有研究[6]指出，该结果与胃癌的异质性及非个体临床治疗有关。多数医务工作者认为，早期干预和治疗是改善胃癌患者预后的重要前提，但传统病理检测取样困难，检测周期长，实施难度较大。近些年随着生物医学的不断进步，多种生物学指标在各类恶性肿瘤的监测中发挥了重要作用。研究[7-8]表明，微小RNA-141(microRNA-141，miRNA-141，miR-141)在乳腺癌、卵巢癌、肾癌等肿瘤组织中呈现低表达态，提示该因子可能参与了恶性肿瘤的发展进程。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是Hippo通路的下游信号分子，已有研究[9-10]证实其具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。本研究探究miR-141和YAP1在胃癌组织中的表达情况，同时分析它们对胃癌细胞增殖的影响，以期为胃癌治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年5月至2021年5月于我院行胃癌手术的40例患者为研究对象，其中男性23例，女性17例；年龄43～68岁，平均(60.18±3.20)岁；肿瘤直径<5 cm者24例，≥5 cm者16例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期15例，Ⅲ-Ⅳ期25例；浸润黏膜下各层16例，浸润浆膜层24例；出现淋巴结转移14例，无淋巴结转移26例。病例纳入标准：均经病理学确诊；均为初次患胃癌；采用根治性或姑息性手术切除，且术前未接受抗肿瘤治疗；随访资料完整齐全。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；妊娠或哺乳期女性；调研前接受放疗者；并发其他影响调研结果疾病者。患者及其家属对本研究均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 胃癌组织及癌旁组织miR-141和YAP1表达水平检测：使用TRIzol试剂(购自上海西格生物科技有限公司)自40例胃癌及癌旁组织样本中提取总RNA，使用Trans Gen Biotech试剂盒(批号：20190921，购自泉州市睿信生物科技有限公司)反转录为cDNA，然后开展实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，检测miR-141表达量。使用福尔马林固定采集的胃癌及癌旁组织，石蜡包埋后连续4 μm切片，采用免疫组化法检测受试组织中YAP1表达情况[试剂盒(批号：20201011)购自上海泽叶生物科技有限公司]。连续检测3次并取平均值作为最终结果。

1.2.2 细胞培养及干预：使用恒温水浴箱于37 ℃条件下将SGC-7901细胞系(由河北医科大学第四医院科研中心提供)复苏，然后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(购自上海博湖生物科技有限公司)中，离心后将细胞转移至细胞培养瓶，开始细胞孵育。光学显微镜下观察细胞生长融合度达到80%以上后进行细胞传代。传代完成后实施细胞转染。将细胞分为阴性对照组、miR-141模拟物转染组(miR-141 mimics组)、miR-141抑制载体组(miR-141 inhibitors组)和YAP1沉默物siRNA YAP1组(siRNA YAP1组)，于37 ℃条件下继续培养72 h。

1.3 观察指标 ①比较胃癌组织及癌旁组织中miR-141和YAP1表达水平；②分析miR-141、YAP1表达情况同胃癌患者临床病理特征如性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、浸润深度等指标的相关性；③采用MTT实验分析miR-141及YAP1对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响：分别于12、24、48、72 h在各组细胞中加入20 μl MTT，37 ℃孵育4 h后加入150 μl DMSO，使用酶标仪检测细胞在570 nm处的吸光度。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件对研究数据开展分析。计量资料用均数±标准差表示，进行正态分布及方差齐性检验，对满足正态分布及方差齐性的数据组间比较采用t检验，方差不齐的数据应用非参数检验中的Mann-WhitneyU检验进行统计推断，对组间计数资料比较使用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中miR-141与YAP1相对表达水平比较 见表1。胃癌组织中miR-141表达水平明显低于癌旁组织，YAP1蛋白表达水平明显高于癌旁组织(均P<0.05)。

表1 胃癌组织与癌旁组织miR-141与YAP1相对表达水平比较

2.2 miR-141、YAP1表达水平与胃癌患者临床病理特征相关性分析 见表2。miR-141表达水平与胃癌患者组织分化程度及TNM分期存在明显相关性(均P<0.05)，与胃癌患者性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移无明显相关性(均P>0.05)。YAP1表达水平与胃癌患者TNM分期、肿瘤直径及组织分化程度相关(均P<0.05)，与胃癌患者性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移无明显相关性(均P>0.05)。

表2 miR-141、YAP1表达水平与胃癌患者临床病理特征相关性分析

2.3 miR-141对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 见图1。在24、48、72 h三个时间点，与阴性对照组比较，转染miR-141模拟物后，胃癌SGC-7901细胞活力出现明显降低，而转染miR-141抑制剂后胃癌SGC-7901细胞活力出现明显升高(均P<0.05)。

2.4 YAP1对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 见图1。在24、48、72 h三个时间点，与阴性对照组比较，转染YAP1沉默物siRNA YAP1的胃癌SGC-7901细胞活力出现明显降低，细胞迁移和侵袭能力明显下降(均P<0.05)。

注：同一时间点三组比较，#P<0.05

3 讨 论

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤[11-12]。数据显示我国胃癌早期诊断率大多低于10%，有70%～80%确诊患者均为胃癌进展期，往往预后较差[13]。2018年全球恶性肿瘤统计数据[7]显示，胃癌患病率位居除非黑色素瘤皮肤癌外的第5位，病死率居肿瘤第3位，东亚地区胃癌患病率位居首位，远超西方国家。我国是胃癌主要集中地区之一，据国家癌症中心数据[14]显示，男性胃癌患病率仅次于肺癌位居第2位，病死率居同期恶性肿瘤第3位；女性胃癌患病率居第4位，病死率仅次于乳腺癌居第2位。虽然当前我国胃癌患者5年生存率已由2000年的30.2%提高至35.9%，但相较日本、韩国等地的60.3%、68.9%仍有较大差距[15]。当前胃癌发病机制尚不清晰，已有研究证实癌基因过度激活、抑癌基因失活以及相关炎症因子动态失衡可能是导致胃黏膜细胞过度增殖出现恶性变的主要原因[16]，当前临床上应用的诸如CEA、CA199等肿瘤标志物因特异性较差，仅能作为胃癌治疗和诊断的参考指标[17]。近些年生物科学的进步使非编码RNA、特异性蛋白等在胃癌诊治中的应用愈加广泛[18]，成为下一步胃癌靶向治疗的重点研究方向。

本研究通过设立对照分组的方式，就miR-141、YAP1在胃癌组织中的表达情况进行了分析，结果显示，相较于癌旁组织，胃癌组织中miR-141明显低表达，而YAP1明显高表达。miRNAs是一种长度在21～25 nt的单链非编码RNA，能够通过与靶基因结合发挥促进或抑制靶基因mRNA表达，进而调控转录进程效果的基因[19]。miRNAs具有强大的生物学功能，研究[20]证实miRNAs在大多数肿瘤中均会出现异常表达，可能对肿瘤的发生和发展发挥着极其重要的作用，因而miRNAs也可能成为新的肿瘤靶向治疗靶点。miR-141是miR200家族中的一员，研究[21]证实miR-141会在上皮性卵巢癌细胞中高表达，而在胃癌细胞中低表达，本研究结果证实了这一点。进一步的研究指出，miR-141表达水平还可能与胃癌患者的临床病理特征明显相关，具体体现在胃癌组织分化程度及TNM分期中，该结果说明miR-141表达可能与胃癌进展、转移以及分化密切相关，这一方面为胃癌的鉴别诊断提供了新的思路，另一方面也为胃癌的靶向治疗提供了新的方向。YAP1是Hippo通路的下游信号因子。研究[10]指出Hippo通路可以通过磷酸化负性调节YAP1，进而影响YAP1蛋白表达，该现象在人类多种肿瘤如结肠癌、直肠癌中均有体现。还有研究[22]指出，YAP1过表达可以协同β-catenin促进肠道干细胞及肿瘤细胞的增殖，这可能也是YAP1在多种肿瘤中出现过表达的重要原因。本研究结果证实了YAP1在胃癌组织中呈现过表达这一现象，同时还发现YAP1表达同胃癌TNM分期、肿瘤直径以及组织分化程度相关，这同样为胃癌的诊治提供了一定的参考。

本研究最后通过细胞实验方式观察了miR-141、YAP1是如何对胃癌细胞生物学行为产生影响的。研究中将SGC-7901细胞分为阴性对照组、miR-141模拟物转染组(miR-141 mimics组)、miR-141抑制载体组(miR-141 inhibitors组)、YAP1沉默物siRNA YAP1组(siRNA YAP1组)，并选择不同物质对其进行了转载培养。观察发现，转染miR-141模拟物后，胃癌SGC-7901细胞活力明显降低，而转染miR-141抑制剂后胃癌SGC-7901细胞活力出现明显升高，这说明miR-141具有抑制胃癌细胞增殖的作用，其原因分析可能为miR-141可通过靶向调控信号转导因子和转录激活因子发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[23]。而转染YAP1沉默物siRNA YAP1的胃癌SGC-7901细胞活力明显降低，细胞迁移和侵袭能力明显下降，说明YAP1过表达能够加速胃癌细胞增殖进程[24]。

综上所述，胃癌组织中miR-141低表达，YAP1高表达，且两者表达水平同胃癌SGC-7901细胞活性密切相关，可以考虑将miR-141和YAP1作为胃癌治疗的新靶点应用于临床。