类器官在器官移植领域的应用前景

赵冰

“我们总是低估五或十年中能够做到的。技术的力量正呈指数级增长，而非线性。”——比尔·盖茨。在2021年同济移植论坛上，题为“类器官：疾病模拟与再生展望”的学术报告，引发了多位器官移植领域专家对类器官再生医学的热烈讨论和思考。本文就类器官的出现、发展和应用进行综述，总结类器官技术的主要应用场景，重点突出其在再生医学领域中的重要价值。随后以肠道类器官和胆道类器官为代表，具体阐述了人源类器官在器官移植中的应用，并就类器官移植应用的瓶颈和未来发展方向展开讨论。

1 类器官技术的出现、发展和应用

1.1 类器官出现的背景

2009年，肠道类器官培养技术的出现是器官发育领域的一项重大进步[1]。基于对肠上皮细胞行为和信号调控机制的充分认识，荷兰科学家以小鼠小肠隐窝底部快速增殖的、Lgr5标记的成体组织干细胞为种子，使用基质胶和多种生长因子营造了模拟体内微环境的体外三维培养体系，最终构建出与体内小肠上皮“绒毛-陷窝”结构高度一致、包含所有细胞类型的“迷你肠道”（图1）。

图1 体外构建小肠类器官示意图Figure 1 Schematic diagram of in vitro construction of small intestinal organoids

1.2 类器官技术的发展

在小鼠小肠类器官培养基础上，科学家通过方法优化，逐步实现了小鼠结肠、人小肠、人结肠、人结肠肿瘤的类器官培养体系[2]。随后，各种衍生自小鼠和人的其他消化道器官上皮的类器官如雨后春笋般大量涌现，包括食道、胆囊、肝脏、胰腺和胃等。使用类似的方法，也可以从其他非消化道上皮组织如乳腺、肺脏、输卵管、前列腺、膀胱等的成体组织干细胞中构建出相应的类器官[3]（图2）。此外，肿瘤组织来源的类器官，包括结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌等类器官，在肿瘤基础研究、药物研发和精准医学中彰显了重要作用[4]。

图2 不同正常组织来源的类器官Figure 2 Organoids derived from different normal tissues

类器官不仅可以从成体组织干细胞培养得到，还可以从胚胎干细胞或诱导多能干细胞定向分化得到，它们都利用了干细胞在合适组织微环境中无限扩增的潜力。相较于胚胎干细胞或诱导多能干细胞，成体组织干细胞长期以来被认为不能在体外二维培养条件下有效扩增，而类器官培养技术的完善已使成体组织干细胞在体外长期稳定扩增成为可能。此外，许多已建立的生物学前沿技术，如CRISPR/Cas9基因编辑、多组学、单细胞测序、冷冻电子显微镜和高分辨率显微镜等技术均可以应用于类器官，这些技术的日益完善进一步放大了类器官在生物学和医学研究中的应用价值[5]。

1.3 类器官的定义与特性

“类器官”（organoid）一词最初用于肿瘤学，早在1946年，Smith和Cochrae就用“类器官”来描述囊性畸胎瘤。在随后的几年里，培养系统中的器官型结构被看作是“类器官”。因此，在经典的发育生物学研究中，虽然三维细胞聚集物并不能完全代表体内组织结构，但依然被称为“类器官”。直到2009年肠道类器官诞生，“类器官”一词才获得了明确的含义——由干细胞经体外三维培养产生的“类似”器官样、具有自我更新和自我组织能力、结构和功能与来源组织或器官高度相似的微型器官[6]。

类器官最重要的特性是在体外培养环境中干细胞具有高度组织记忆和自我组装能力，能够自己长成类似于体内组织的结构，高度还原体内器官的细胞构成和功能，并且在长期扩增的同时保持遗传和表型稳定，解决了传统研究模型无法实现人源化和组织模拟的痛点，为基础研究和医学转化提供了一个很好的模型系统[7]。

1.4 类器官技术的应用场景

类器官技术的发展促进了人们对疾病模型、药物研发、精准医学、发育生物学、病原微生物宿主相互作用、毒理学、基因编辑以及再生医学的深入研究[8-26]（图3）。下面，我们将举例说明类器官的主要应用场景。

图3 类器官技术的主要应用场景Figure 3 Main application scenarios of organoid technology

1.4.1 疾病模型 类器官非常适合用于传染病研究，特别是局限于人类并且依赖于特定细胞类型的病原体的研究。比如，利用肠道类器官模拟隐孢子虫的体内感染，发现隐孢子虫可以在肠道类器官中大量复制并完成其生命周期，充分说明肠道类器官细胞适合其生长和繁殖[27]。在传染病的研究中最引人注目的便是利用类器官研究新型冠状病毒SARS-CoV-2对人体的致病机制。2020年初，我国国民健康受到新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）的严重威胁，但新冠肺炎致病机制研究和药物开发缺乏人体组织模型。我们团队依靠自身成熟的人源类器官技术，构建了人源类器官新型冠状病毒感染模型，发现新型冠状病毒可以高效侵染并损伤人体肝脏组织，揭示了临床新冠肺炎患者肝损伤出现的诱因[28]。这是在国际范围内首次为新型冠状病毒呼吸系统以外的器官侵染和损伤提供直接实验证据，也引领了国际多个独立研究组利用肠道、肾脏、血管、肺脏、大脑等人源类器官探究新型冠状病毒的嗜性和致病机制。《Nature News》于2020年6月进行了专题新闻报道《微型器官揭示新型冠状病毒如何破坏机体》，并在《Nature》官网主页高亮我们的工作。这些工作凸显了类器官技术在应对人类突发重大感染性疾病时的重要价值。

1.4.2 药物开发 肠道、肝脏、肾脏等器官对药物或环境改变较为敏感，易受到药物毒性作用发生应激和损伤。培养成体组织干细胞或者多能干细胞来源的肠道、肝脏、肾脏等类器官，能够为新药进入临床前的毒性评价提供体外人源化模型[29]。

此外，多种疾病、肿瘤类器官大规模生物样本库的建立将加快药物开发的进展，使得能够针对特定疾病来筛选大量药物，或者使用特定药物针对特定疾病的不同亚型进行筛选。尤其对于因患者数量少而无法进行大规模临床试验的罕见遗传疾病，类器官技术可为药物开发提供解决方案[30]。

1.4.3 精准医疗 类器官技术能够在体外快速地测试特定患病组织对不同药物的反应。肿瘤的治疗一直是全球的重大健康科学问题。利用类器官培养技术，可以从患者来源的肿瘤组织样本中建立肿瘤类器官，并在体外测试肿瘤对于放射治疗或者化学药物治疗、靶向药物治疗、免疫细胞治疗等的有效性。另外，建立肿瘤类器官样本库，通过基因组测序联合药物敏感性测试的大数据分析，可使得将肿瘤的遗传背景与药物反应联系在一起成为可能[31]。研究人员构建了结肠癌患者不同位置肿瘤的类器官，发现各个区位肿瘤所突变都不同，且转录组和甲基化水平也存在差异，而肿瘤类器官可以很好地保留这些肿瘤异质性[32]。

1.4.4 再生医学 类器官在再生医学领域中的应用是将成体组织干细胞培养得到的类器官移植回体内，修复受损组织[26]。目前成体组织干细胞在临床上的移植应用仅限于利用造血干细胞移植来治疗自身免疫性疾病、白血病和淋巴瘤，这主要得益于造血干细胞的自身特性，造血干细胞在骨髓中以单个悬浮状态生长，其体外培养、移植都很容易实现。但是其他成体组织干细胞，包括肠道、肝脏、肺脏、肾脏等成体组织干细胞的生长需要非常紧密的细胞连接和微环境支持，将这些细胞分离培养本身就很难，移植就更无法实现。而类器官可作为这些细胞在体外存活、高效扩增和移植的载体，为成体组织干细胞再生医学应用注入强心剂。国家重点研发计划已从“十三五”的“干细胞及转化研究”发展为“十四五”的“干细胞研究与器官修复”，重要变化之一就是将类器官列为主要研究和发展方向，进一步提示类器官有可能成为器官修复取得重大突破的关键。

2 类器官在器官移植领域的应用前景

2.1 类器官与再生医学

类器官技术与再生医学渊源颇深。事实上，类器官在诞生之初就将再生医学作为它的愿景，将类器官应用于器官移植领域的尝试从未间断。早在类器官技术开发的早期，研究人员便在小鼠模型中尝试使用肠道类器官修复受损的组织[33]。通过将体外培养的类器官直接灌注到结肠炎小鼠肠内，研究人员发现类器官能够修复受损的肠上皮，外源的类器官修补了隐窝结构，其结构和细胞组成均与小鼠自身肠道相同，经过类器官治疗的小鼠健康状况也逐渐恢复，这充分展现了类器官在再生医学领域的巨大潜力。

理论和实践总是结伴而行，在肠道类器官成功治疗了结肠炎小鼠后，科学家们意识到体内移植实验不仅仅是检验类器官分化能力的方法，更是通向组织再生的光明道路。随着各种新型类器官的开发，类器官移植也在肝脏、肝外胆道、肺脏、胰岛、大脑、皮肤等系列组织器官中得到实践[34-39]，得益于其独特的增殖能力和组织特异性，类器官移植能够很好地还原和修补体内的结构而不发生畸形或肿瘤[40]。更振奋人心的是，在1型糖尿病模型中，使用胰岛类器官的治疗效果优于直接使用组织分离的新鲜胰岛细胞[41]，这进一步表明类器官在再生医学中的前景和独特优势。

2.2 人源类器官移植探索

目前已有多种不同类型的类器官被报道用于移植，但仅限于原位或异位移植到小鼠、大鼠或鸡胚上，包括肾脏、肠道、肝脏、胰腺、大脑、心脏、肺脏、视网膜等，可实现类器官在体内的生长和一定时期的维持。

2.2.1 肠道类器官移植治疗短肠综合征 小肠是吸收营养的主要器官，大规模切除小肠会导致短肠综合征（short bowel syndrome，SBS），这是一种严重的吸收障碍，以腹泻、脱水和体质量减轻为特征。患者常常需要接受全肠外营养以弥补营养不足，或使用肠激素类似物或进行外科手术。当以上策略都失效或出现了严重肠外营养支持并发症时，肠道移植成为了治疗SBS最后的选择。

自2009年Hans Clevers团队首次建立小肠类器官以来，类器官技术已经可以实现人肠上皮组织在体外的无限扩增，这使肠道类器官成为再生医学中极具潜力的移植物。但由于小肠是一个高度血管化并依赖肌肉组织和神经系统以发挥正常功能的器官，体外构建包含复杂间质支持系统的小肠类器官仍是一个挑战。

2021年年初Toshiro Sato团队在《Nature》上报道了大鼠中移植小肠类器官可改善严重的SBS[42]。基于小肠和结肠上皮下结构的相似性，作者使用回肠类器官替代天然结肠上皮，可以生成一个高度血管化且具备功能的小肠化结肠，其能够形成包含脉管系统和神经支配、绒毛结构和乳糜管在内的完整的小肠结构。将小肠化结肠移植到SBS大鼠中，可恢复其吸收功能并显著改善肠衰竭，同时对肠道菌群的重塑有一定作用。因类器官可以由单个干细胞生长而成，即使是SBS患者短残小肠的活组织检查标本也足以提供适合自体移植的干细胞资源。该研究证实了利用肠道类器官实现再生的可行性，对大型动物和人类也具有治疗潜力，为其他管腔器官的再生移植提供了新策略。

2.2.2 胆道类器官移植修复受损胆道 目前能够实现类器官移植并在体内存活的研究仅局限于动物模型，关于类器官在人体中的安全性和有效性一直未见报道。2021年2月，《Science》首次报道了在人体器官上进行类器官移植的成果，通过将体外培养的胆道类器官移植到离体条件下的人类肝脏中，可实现受损胆道的修复和再生[43]。该研究首先将胆囊来源的胆道上皮细胞在体外培养成类器官，并移植到肝脏胆道疾病的小鼠模型中，发现受损的肝内胆道的确能够被修复，这意味着肝外细胞可用于修复急性肝内胆道损伤。随后研究人员对因胆道损伤而被放弃用于移植的人类供者肝脏使用了常温灌注系统，使肝脏在长时间离体条件下维持其生理功能，将其作为人体模型评估胆道类器官修复人类胆道的治疗潜力。作者将胆囊类器官移植到肝内胆道中，发现移植物可保留在胆道腔室内并与受者形成连接，并实现胆道的再生和胆汁性质的改善，与小鼠模型中的数据相互印证。该研究的卓越之处在于首次证实了利用实验室中培养的类器官可以在人体器官上实现移植并发挥作用，开辟了人源类器官移植的新道路，为类器官移植应用于临床奠定了基础。

2.3 类器官移植应用的瓶颈与未来发展方向

2.3.1 伦理法规、临床试验 细胞治疗指的是将从患者体内获得的正常细胞或具有特定功能的细胞在体外扩增或生物改造后重新输入患者体内，修复其受损的组织器官或增强免疫反应，从而实现疾病的治疗。细胞治疗主要包括干细胞治疗和免疫细胞治疗两种，已在器官移植、肿瘤治疗、免疫性疾病治疗等领域展现出了独特魅力。

自20世纪90年代以来，我国出台了多项政策和法规以规范化细胞治疗的研究和转化，如《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则》《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则》等。由于细胞治疗所使用的对象和方法过于多样，相关的标准和指南需要不断更新，也就导致了细胞治疗的审批往往比较细致和复杂。类器官作为多种细胞类群的集合体，其相关研究和转化的审批与细胞治疗相同，但由于其细胞类群更加多样性也更加复杂，对其进行标准化和审批也更加困难。我们正在与华中科技大学同济医学院附属同济医院团队合作，开展类器官修复缺血-再灌注损伤的临床前研究，尝试建立移植用类器官的精细评价。

2.3.2 类器官技术标准化及人源类器官培育规模化 由于细胞来源和个体来源的多样性，世界上不存在两个完全相同的类器官，而干细胞的多向分化能力也导致一个类器官内部存在较大异质性，这种复杂性可能会为类器官应用于人体带来一定风险。GMP（good manufacturing practice）意为“良好生产规范”，是一套适用于食品、药品和医疗产品的强制性标准。产品生产必须符合GMP要求，产品质量必须达到法定标准，因此产品生产过程中的方方面面都需要被评估和规范化，最终确保产品质量的稳定性、安全性和有效性。类器官技术最终转化到临床应用成为一种医疗产品，也必须实现GMP标准化。

血清是体外细胞培养中最常见的添加物之一，其中所包含的各种血浆蛋白、生长因子等能够为细胞生长提供良好的条件，但血清中尚有部分成分未知，且质量不够稳定，因此使用类器官培养体系的最大优势就是去除血清，以此规避一切可能因血清质量不佳或不稳定而带来的负面影响。在缺乏血清的培养环境中，类器官的生长不得不依赖额外添加的生长因子，而不同细胞所需要的生长因子种类、浓度及添加顺序也不同，因此对生长因子进行GMP标准化并不容易。此外，类器官三维结构的形成离不开基质胶为其提供空间支持，目前最常用的基质胶来源于小鼠肉瘤的基底膜基质，将这种动物肿瘤来源的物质用在人体中必须考虑安全问题，这也成为了类器官技术应用于人体的最大安全评价障碍。

为支撑推进类器官移植应用，我们团队在生长因子GMP标准化、基质胶取代和类器官大规模培育方面进行了诸多努力，尤其是实现了在胆道类器官培养中使用小分子药物组合完全代替4种生长因子[44]，而开发不依赖基质胶的类器官发酵工艺也在顺利推进中。

2.3.3 基于类器官的复杂人工器官构建 体外培育器官一直是科学家的梦想，而类器官仅仅是迈出的第一步。构建更接近体内器官高级结构的复杂人工器官是前沿科研的需要。在肠道研究中已有使用3D打印技术或脱细胞骨架的方法来构建人工肠道的案例[17，45]，通过为类器官提供接近体内组织空间结构的培养环境，研究人员打破了传统培养皿培养的束缚，突破性地产生了具有肠道宏观解剖结构的人工肠道，并能够还原肠道的微生物环境。在类器官基本单元基础上，融合多种组织工程策略，构建高级复杂人工器官将得到更多关注。但值得注意的是类器官技术本身标准化还有诸多工作要做，且高级复杂人工器官未来应用于再生医学，更多期待是解决全局性器官缺陷，在修复局部组织损伤上，类器官或许具有更好的移植相容性，这些也需要认真评价。

3 小 结

类器官具有在体外模拟真实器官三维结构、细胞组成和功能的特性，使其在生物医学和再生医学领域拥有广阔的应用前景。作为突破性前沿技术，类器官在器官移植领域的应用仍处于初步的、待研究开发的状态，虽已有诸多类器官移植的积极数据，但距离大规模临床应用仍较远，需要整个领域的不断努力探索。如何推进类器官再生医学健康、快速发展，使器官移植借力生命科技迅猛发展的东风进入新的时代，始终保持我国器官移植走在国际最前沿，是我们共同的期待和使命。