miR-152 通过靶向FGF2 抑制肺癌A549 细胞系的增殖侵袭

何磊，杜佳辉，李娜

（1.郑州人民医院急诊科，郑州 450000；2.河南省胸科医院胸外科，郑州 450000）

肺癌是一种呼吸系统恶性肿瘤疾病，其病死率位居恶性肿瘤之首[1]。目前，关于诊断肺癌的方案主要检测肿瘤标志物、支气管镜检查、痰脱落细胞学检测、胸腔积液检测以及胸部计算机断层扫描等[2]。由于肺癌发病前期不明显，大部分患者确诊时候已处于中晚期，所以5 年生存率比较低[3]。因此，寻找用于肺癌的诊断和治疗的新靶点至关重要。近年来自噬作为抗肿瘤研究的热点，在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色，一方面其通过降解聚集的蛋白质和功能性障碍的细胞器，减少细胞内氧化应激反应。另一方面，自噬调控肺癌细胞增殖、侵袭和凋亡等过程[4]。

微小RNA（miRNA）是长度在20～24 个碱基的单链非编码小RNA[5]。研究表明，miRNA 与信使RNA（mRNA）碱基互补配对，从而降解靶mRNA 或抑制其翻译，进而参与转录后的调控[6]。越来越多研究发现，miRNA 参与肿瘤发生和发展，主要调控肿瘤细胞的自噬、增殖、迁徙和侵袭等过程[7-8]。研究发现，miR-21 和miR-23a 可成为肺癌早期诊断的标志物[9]。并且miRNA-31 和let-7a 在肺癌患者中的异常表达，为肺癌早期诊断提供参考意义[10]。研究发现，miR-144 表达增加后，肺癌细胞中自噬激活后，从而抑制细胞的增殖和迁移[11]。因此，特异性表达的miRNA 可成为肺癌诊断和治疗的标志物。

miR-152 参与多种肿瘤的发生、发展过程，研究表明，在肺癌患者血清中检测miR-152 异常表达，并且显著性低于正常人群[12]。在早期非小细胞肺癌诊断中，血清外泌体中的miR-152 可以作为辅助诊断标志物[13]。但miR-152 影响肺癌A549 细胞的作用及机制仍不明确。成纤维细胞生长因子-2（FGF2）是一种广泛存在人体各组织中的肽类丝裂源[14]。由于FGF2 常参与细胞自噬过程[15]，对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭具有重要作用[16]。本研究通过脂质体转染技术构建miR-152 过表达以及FGF2 过表达的肺癌A549 细胞，检测miR-152 与FGF2 互作关系，探究miR-152 和FGF2 对肺癌A549 细胞的自噬、增殖和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 正常上皮细胞BEAS-2B 和肺癌A549细胞系均购自中科院上海细胞库。

1.1.2 试剂及试剂盒 FBS 胎牛血清、MEM 培养基和0.25%的胰蛋白酶（Gibco，Waltham，MA）；miRNA空转化合物、FGF2 过表达空转质粒、miR-152 mimic和miR-152 shRNA 以及FGF2 过表达质粒（广州市锐博生物科技有限公司）；opti-medium 培养基、lip3 000、Trizol 试剂和BCA 试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，lnc）；Dual Luciferase Reporter Assay System 试剂盒（psiCHECK-2 vector; Promega，Madison，WI，USA）；0.25%甲紫溶液（索莱宝科技有限公司）；Transwell 小室（密理博科技有限公司）；PrimeScript TM RT 试剂盒（Takara Biotechnology）；SYBR Green Ⅰ[宝日医生物技术（北京）有限公司]；RIPA 缓冲液、SDS-PAGE 和PVDF 膜（Sigma-Aldrich 中国）；牛血清白蛋白（盐城赛宝生物科技有限公司）；PMSF 抑制蛋白降解液（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗人FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62 和GAPDH 单克隆抗体（Cell Signaling Technology，Inc.）；羊抗兔二抗[艾博抗(上海)贸易有限公司]；一抗稀释液和二抗稀释液（北京百奥莱博科技有限公司）；超敏发光液ECL（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 细胞培养 正常上皮细胞BEAS-2B 和A549细胞通过快速升温复苏后，10%FBS 的MEM 培养液分别制成细胞混悬液，放入培养皿后，于37℃恒温，5%CO2的培养箱中。隔天进行传代1 次，实验使用的细胞为对数生长期的细胞。

1.3 细胞转染及分组 将正常上皮细胞BEAS-2B（正常上皮细胞组）和A549 细胞（肺癌A549 细胞组）接种于6 孔板，待其长至密度80%～90%后，为下一步实验做准备。再将A549 细胞分为miR-NC 组、pcDNA3.1-NC 组、miR-152 mimics 组、miR-152 inhibitor 组、pcDNA3.1-FGF2 组 和miR-152+pcDNA3.1-FGF2 组。miR-NC 组是miRNA 空转物干扰A549 细胞，pcDNA3.1-NC 组是FGF2 过表达的乱序质粒干扰A549 细胞，miR-152 mimics 组是miR-152 过表达质粒干扰A549 细胞，miR-152 inhibitor组是miR-152 沉默质粒干扰A549 细胞，pcDNA3.1-FGF2 组是FGF2 过表达质粒干扰A549 细胞，miR-152+pcDNA3.1-FGF2 组是miR-152 过表达质粒和FGF 过表达质粒同时干扰A549 细胞。转染步骤：将对数生长的A549 细胞种于6 孔板内，待其长至密度40%～50%。用opti-medium 培养基稀释对应的质粒后，再与lip3000 混匀孵育15 min 后，加入孔内。待转染8 h 后，弃去转染液。添加正常培养基进行培养，当细胞长至80%～90%，放在荧光倒置显微镜观察转染效率。转染率超过80%，可进行下一步实验。

1.4 双荧光素酶报告实验 双重荧光素酶报告基因检测使用Dual Luciferase Reporter Assay System试剂盒。将FGF2 非翻译区（UTR），包含miR-152 预测结合位点的3′UTR，所有各自结合位点突变型（Mut）3′UTR 的片段插入psiCHECK-2 载体，再通过DNA 测序验证所有构建体。将含有野生型（Wt）或Mut 的psiCHECK-2 载体转染到有或没有合成miR-152 模拟物细胞中。转染36 h 后，使用双重荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，以海肾活性标准化。

1.5 细胞克隆检测细胞增殖能力 取miR-NC 组、pcDNA3.1-NC 组、miR-152 mimics 组、miR-152 inhibitor 组、pcDNA3.1-FGF2 组和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 组对数生长时的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化后，1 000×g 离心10 min 收集细胞后，用10% FBS 的MEM 培养基混匀制成单细胞混悬液。每组将1 000 个细胞接种于6 孔板内，培养10～14 d，当观察孔内有肉眼可见的克隆，就终止培养。用PBS洗涤2～3 次后，甲醇固定15 min，加入适量的0.25%甲紫溶液染色。在倒置显微镜计算大于50 个细胞的克隆数，最后统计分析每个孔的克隆数，该实验每组需要设立3 个复孔，并且独立重复操作3 次。

1.6 Transwell 小室检测细胞侵袭能力 Transwell小室上层添加100 μL 的Matrigel 生物胶，在培养箱中培养40 min 后，再分别加入100 μL MEM 混合1×104个miR-NC 组、pcDNA3.1-NC 组、miR-152 mimics 组、miR-152 inhibitor 组、pcDNA3.1-FGF2 组和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 组的细胞。而Transwell小室下室加100 μL 10% FBS 的MEM 培养基，再置于培养箱培养12 h。弃去上清液，PBS 洗涤3 次，再用甲醇固定15 min 后，0.25%甲紫溶液染色1 h。将小室放在倒置显微镜下随机选取5 个视野（200×），拍照记录迁移下室的细胞总数。该实验每组需要设立3 个复孔，并且独立重复操作3 次。

1.7 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达水平 将miR-NC 组、pcDNA3.1-NC 组、miR-152 mimics 组、miR-152 inhibitor 组、pcDNA3.1-FGF2 组和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 组细胞长至80%～90%通过胰酶消化，1 000×g 离心收起细胞后用蛋白裂解液（RIPA 缓冲液：PMSF 抑制蛋白降解液=100：1）裂解后提取总蛋白。BCA 试剂测得各组的总蛋白浓度后，都调成一致浓度，再100℃变性后保存于-20℃。总蛋白电泳分离后，将其转膜至PVDF膜。用3%牛血清白蛋白液封闭2 h 后，TBST 洗涤3 次，每次10 min。将其放入对应的一抗混合液（一抗1∶1 000）（FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62 和GAPDH），在4℃孵育过夜。用TBST 洗涤3 次，每10 min 1 次，放入二抗和3%牛血清白蛋白液（1∶4 000）混悬液中，室温孵育2 h。TBST 洗涤3 次，每次10 min，将超敏发光液ECL 滴在膜上，放入化学发光成像仪（Invitorgen，USA）进行蛋白显影。通过Image J 软件进行分析结果，相对蛋白表达以GAPDH 标准化。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0 软件进行数据处理，所有实验数据为重复3 次实验结果。计量资料中符合正态分布资料以±s 表示，软件采用One way ANOVA 单因素分析，多组间的两两比较采用SNKQ 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-152 在正常上皮细胞BEAS-2B 和肺癌A549 细胞中的表达情况 qPCR 结果如图1A 和1B所示，与正常上皮细胞BEAS-2B 比较，肺癌A549 细胞中的miR-152 表达量显著降低（P＜0.01），而FGF2的mRNA 表达量显著增加（P＜0.01）。

图1 qPCR 检测正常上皮细胞和A549 细胞中miR-152 和FGF2的表达情况Fig 1 The expression of miR-152 and FGF2 in normal epithelial cells and A549 cells detected by qPCR

2.2 FGF2 是miR-152 的靶点 根据TargetScan 的预测，miR-152 3′ -UTR 中的靶向位点与FGF2 部分互补（图2A）。假设FGF2 与miR-152 基因的3′-UTR 结合，从而抑制了miR-152 的基因表达。双重萤光素酶活性测定结果如图2B 所示，miR-152-Wt组的相对萤光素酶活性显著少于NC 组（P＜0.05），但miR-152-Mut 组在萤光素酶活性方面与NC 组比较，无统计学差异。这表明miR-152 是FGF2 的直接靶标。

图2 双荧光素酶检测FGF 与miR-152 关系Fig 2 Relationship between FGF and miR-152 detected by dual luciferase

2.3 miR-152 靶向FGF2 对肺癌A549 细胞增殖的影响 二维克隆实验结果如图3A 和3B 所示，miR-152 mimics 组细胞形成的克隆数（42±3.21）显著低于miR-NC 组（214±10.23）（t=-48.88，P＜0.05），而miR-152 inhibitor 组克隆数（352±4.23）显著高于miR-NC 组（t=-27.68，P＜0.05）。pcDNA3.1-FGF2 组细胞形成的克隆数（501±6.12）显著高于pcDNA3.1-NC 组（124±11.43）（t=-42.18，P＜0.05）。miR-152+pcDNA3.1-FGF2 组细胞形成的克隆数（187±6.21）显著高于miR-152 mimics 组（42±3.21）（t=-32.25，P＜0.05）。

图3 二维克隆法检测肺癌A549 细胞克隆能力Fig 3 The clonal ability of lung cancer A549 cells detected by twodimensional cloning method

2.4 miR-152 靶向FGF2 对肺癌A549 细胞侵袭的影响 Transwell 实验结果如图4A 和4B 所示，miR-152 mimics 组穿过基质胶膜的细胞数为（35±4）个，显著低于miR-NC 组（101±5）个（t=-19.82，P＜0.05），而miR-152 inhibitor 组（162±5.03）个，显著高于miR-NC 组（t=-22.33，P＜0.05）。pcDNA3.1-FGF2 组穿过基质胶膜的细胞数为（199±6）个，显著高于pcDNA3.1-NC 组（98±4）个（t=-10.64，P＜0.05）。miR-152+pcDNA3.1-FGF2 组穿过基质胶膜的细胞数为（78±3）个，显著高于miR-152 mimics 组（t=-8.19，P＜0.05）。

图4 Transwell 小室检测肺癌A549 细胞侵袭能力（200×）Fig 4 The invasiveness of lung cancer A549 cells detected by Transwell chamber（200×）

2.5 miR-152 靶向FGF2 对肺癌A549 细胞自噬相关蛋白的影响 Western 印迹实验结果如图5A 和5B 所示，与miR-NC 组比较，miR-152 mimics 组FGF2 和p62 蛋白表达量显著减少（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表达量显著增加（P＜0.05），而miR-152 inhibitor 组FGF2 和p62 蛋白表达量显著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。与pcDNA3.1-NC 组比较，pcDNA3.1-F GF2 组FGF2 和p62 显著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表达量显著减低（P＜0.05）。与miR-152 mimics 组比较，miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 组FGF2 和p62 显著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表达量显著增加（P＜0.05）。

图5 Western 印迹检测A549 细胞内FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1和p62 蛋白表达情况Fig 5 The expression of FGF2，LC3BⅡ/Ⅰ，beclin1 and p62 proteins in A549 cells detected by Western blotting

3 讨论

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，恶性程度高且临床预后较差[17]。肺癌容易复发和转移，大部分患者确诊时已经处于中晚期[18]。目前，对于肺癌治疗的手段主要是手术和化疗等综合治疗方案，在一定程度能缓解病情，但是生存期仍不乐观[19]。研究表明，细胞自噬是机体的一种自我保护机制，其在应激条件下降解癌细胞产生的损伤细胞器和有害的蛋白质物质，可以阻止癌症的发生和发展[4]。LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1 和p62 是主自噬标志物，LC3BⅡ/Ⅰ和beclin1 蛋白表达量随着自噬水平升高而升高。自噬降解受到抑制时，p62 的表达量增加[20]。越来越多研究表明，非编码RNA 通过参与自噬调控网络，介导自噬相关基因的表达，从而参与癌症细胞的增殖和侵袭过程[21]。因此，深入了解肺癌的发病机制，寻找与其自噬、增殖和侵袭相关的信号分子，可进一步提高肺癌的生存率，改善临床预后。

研究表明，miRNA 表达和功能异常常与肿瘤的发生、发展有密切关系[22]。研究表明，miR-152 抑制胃癌细胞、膀胱癌细胞和卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[23-25]。因此，miRNA 有可能参与肺癌A549 细胞的增殖和侵袭调控。本研究发现，与正常上皮细胞比较，miR-152 在肺癌A549 细胞中的表达显著降低。这说明miR-152 可能对肺癌A549 细胞有影响作用。笔者进一步构建miR-152过表达和沉默的肺癌A549 细胞。qPCR 结果显示，与miRNC 组比较，miR-152 mimics 组的miR-152 表达量显著增加，miR-152 inhibitor 组表达量明显减少。这说明miR-152 过表达和沉默的肺癌A549 细胞模型构建成功。细胞克隆和Transwell 小室实验结果显示，肺癌A549 细胞中miR-152 过表达后，其增殖和侵袭能力显著降低，而miR-152 沉默后，其增殖和侵袭能力明显增加。与miR-NC 组比较，miR-152 mimics 组的自噬标志蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 增加，而p62表达量受到抑制，但miR-152 inhibitor 组的结果与之相反。这说明miR-152 能激活肺癌A549 细胞的自噬，从而降低其增殖和侵袭能力。

FGF2 属于一种重要的神经营养因子和血管生成因子，能促进细胞的增殖和基因表达等[14]。FGF2通过调控肿瘤血管生成，从而参与肿瘤的生长、侵袭和转移过程[16]。本研究发现，与正常上皮细胞比较，肺癌A549 细胞中的FGF2 的表达显著增加。进一步通过过表达肺癌A549 细胞中的FGF2，观察FGF2 对肺癌A549 细胞的影响。qPCR 结果显示，与pcDNA3.1-NC 组 比 较，pcDNA3.1-FGF2 组 中 的FGF2 表达量增加，说明肺癌A549 细胞过表达FGF2模型构建成功。细胞克隆和Transwell 小室实验结果显示，肺癌A549 细胞中FGF2 过表达后，其增殖和侵袭能力显著增加。这说明FGF2 的过表达激活肺癌A549 细胞的增殖和侵袭能力。本研究进一步证实，过表达FGF2 后，肺癌A549 细胞中的FGF2 和p62明显增加，LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 表达受到抑制。这提示FGF2 抑制自噬，从而激活肺癌A549 细胞的增殖和侵袭。

越来越多研究发现，miRNA 与mRNA 相互竞争，从而影响靶基因的转录[6]。研究表明，miR-152通过与神经纤维网蛋白1 相互竞争，从而抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭能力[12]。本研究通过TragetScan 预测miR-152 与FGF2 具有特异性结合，双荧光报告基因实验进一步验证miR-152 通过与FGF2 的3′UTR 区域直接结合从而负调控FGF2的表达。为了进一步验证miR-152 靶向FGF2 对肺癌A549 细胞的影响，本研究在过表达miR-152 的基础上过表达FGF2 基因，与miR-152 过表达组比较，其细胞自噬能力明显抑制，而增殖和侵袭能力显著增加。这也提示，过表达FGF2 基因可逆转过表达miR-152 对肺癌A549 细胞增殖和侵袭的抑制作用，进一步证实FGF2 是miR-152 的靶基因。

综上所述，miR-152 可靶向FGF2 调控肺癌A549 细胞自噬，从而影响A549 细胞增殖和侵袭能力，为肺癌的靶向治疗和诊断提供潜在靶点。