云南省某养鸡场鼻气管鸟杆菌核酸检测及其16S rDNA 基因序列分析

胡 骑，张振兴，宋建领

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

鼻气管鸟杆菌病是由鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale，ORT）引起禽类的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，鸡和火鸡易感。该病以呼吸困难、生长障碍及严重的纤维素性化脓性肺炎和气囊炎为特征。ORT 常与禽流感病毒（AIV）、大肠杆菌、传染性鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒（ILTV）等病原混合或继发感染，导致感染鸡群生长缓慢，死亡率增加，给养禽业造成巨大经济损失[1-2]。该病原1981 年由德国学者发现，1994 年比利时学者建议使用“鼻气管鸟杆菌”这个术语，之后在美国、德国、英国、法国、以色列、荷兰、南非等许多国家被发现[3]。2000年陈小玲等[4]在我国首次分离到ORT。泰国、伊朗以及我国台湾地区进行流行病学和血清型调查，发现ORT 阳性率很高。目前该病分布广泛，可能呈世界性蔓延[5]。本研究对云南省易门县某养鸡场能导致相似临床症状的相关病原进行核酸检测，证实病原为ORT，经16S rDNA 基因序列分析，发现病原变异较少，这对于指导该地区鸡群细菌病防控具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2020 年12 月初，云南省易门县某养鸡场出现大量流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀、食欲下降和生长缓慢等症状的鸡只。12 月9 日，取病死肉鸡鼻腔黏液及肺、气管等组织，混合剪碎研磨，按照体积比1:10 加入PBS，反复冻融3 次后，3 000 r/min 离心10 min，取上清液提取核酸。

1.1.2 试剂 RNA/DNA 核酸提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0，胶回收试剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，PCR 试剂盒PremixTaq（TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye），RT-PCR 试剂盒PrimeScript Onestep RT-PCR Kit Ver.2，均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 按照RNA/DNA 核酸提取试剂盒说明书，提取组织上清液核酸。

1.2.2 引物合成 根据国内外已发表的ORT、ILTV、AIV、鸡副嗜血杆菌（ICV）基因序列及相关文献[6]，分别设计检测引物，检测能引起肉鸡呼吸道症状的上述常见病原核酸。引物序列信息见表1。

表1 病原核酸检测引物序列

1.2.3 病原核酸检测 通过RT-PCR/PCR 方法分别检测AIV、ILTV、ORT、ICV 核酸。AIV 的RT-PCR 扩增体系（25.0 μL）：2×1 Step Buffer 12.5 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL、上游引物（AIV-F）0.5 μL、下游引物（AIV-R）0.5 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL、模板RNA 2.0 μL。RTPCR 扩增程序：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸7 min。其他各病原（ILTV、ORT、ICV）的PCR 扩增体系（25.0 μL）：rTaq12.5 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL，病原的上、下游引物均为0.5 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

1.2.4 16S rDNA 核苷酸序列分析 将PCR 检测阳性样品产物，用胶回收试剂盒进行DNA 回收后，送昆明擎科生物公司测序；采用MEGA 11 软件，对16S rDNA 进行序列比对和系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 病原核酸检测

在采集的鼻腔黏液以及肺、气管等组织样品中检出ORT 核酸阳性，而ILTV、AIV 和ICV 均为阴性（图1）。

2.2 16S rDNA 基因序列分析

通过BLAST 比较后，自GenBank 数据库中下载国内外公开的ORT 16S rDNA 基因序列和同源性高的ORT 16S rDNA 基因序列，采用MEGA 11软件进行序列比对和系统发育分析。ORT 阳性样品16S rDNA 基因与ORT14/16株、CH-P940508株的同源性均为99.9%，与土耳其/匈牙利1997株、土耳其/匈牙利2009株及ESV60、ESV207株的同源性均为99.7%（图2）。系统进化分析结果显示：ORT 阳性样品16S rDNA 基因与ORT14/16株、CH-P940508株、土耳其/匈牙利1997株和土耳其/匈牙利2009株在同一个分支内，均属于基因群I型（图3）。

3 讨论

禽鼻气管鸟杆菌病在全球范围内流行，目前呈快速蔓延趋势[7]。其易感动物种类繁多，尤以禽类最为易感，禽类感染后主要表现流鼻涕、呼吸紊乱等呼吸道症状，以及生长迟缓、采食量及肉增重减少、蛋鸡产蛋量降低等。在本研究案例中，临床剖检发现病鸡的肺、气管均出现肿胀、充血以及鼻腔黏液增多等明显炎症情况，与文献[8-10]报道的该病病理变化多见气囊炎、单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、胸膜炎等一致。目前，ORT 的病原学及其感染的防控技术等研究还不够深入。由于ORT 血清型众多，且常与其他细菌或病毒发生混合感染，因此有必要深入研究ORT 的致病机理，进一步探究该病的防治策略。

全长16S rDNA 核苷酸同源性和系统进化关系显示，本次从云南省检出的ORT 阳性样品与6株英国分离株LMG 的同源性相差较大，但与伊朗分离株（ORT8/15、ORT14/16）和土耳其/匈牙利分离株（OR006/turkey/Hungary/2009、OR035/turkey/Hungary/1997）的同源性均在99.7%以上，都处于同一分支内，与李富祥等[11]2014 年报道的情况一致，说明云南省鸡源ORT 在过去8 年内突变较少。

ORT 单独感染时危害不大，死亡率也不高，临床症状较轻微，容易被养殖者忽视，导致后期发生混合感染，病程延长，用药治疗效果差，危害加大。目前国内对ORT 重视程度有待加强，病原研究不够充分，也没有相应疫苗可用，建议做好生物安全措施，减少各类应激，加强饲养管理，防止家禽发病，从而减少经济损失。云南省是全国重要的养鸡大省，2021 年全省出栏肉鸡3 亿只以上，绝大部分为大型集约化养殖，规模化养鸡场的ORT 检出率为20%[7]，推算全省约有6 000 万只鸡感染，一旦发病，可能造成难以估量的经济损失。故建议家禽养殖企业在重视传染性和致死性巨大的禽流感、新城疫、马立克氏病等病毒病的同时，重视细菌病给生产带来的影响。