山豆根抗鼻咽癌活性成分的筛选

南俊伶 王超众 闫广利 吴芳芳 宋志军 王硕 周小雷 缪剑华 王喜军

关键词山豆根;鼻咽癌;活性成分;越南槐醇;山豆根素;高丽槐素

山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根茎，又名广豆根，具有清热解毒、消肿利咽的功效，可用于治疗火毒蕴结、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛、口舌生疮[1]。现代药理学研究表明，山豆根具有抗肿瘤、抗病毒及增强免疫等药理作用[2-3]。鼻咽癌是发生于鼻咽黏膜被覆上皮及小涎腺的恶性肿瘤，是我国南方地区的高发性疾病[4]。目前临床治疗鼻咽癌的常用方法是放疗、化疗等，但均具有副作用，因此，亟待开发治疗鼻咽癌的有效新药。相关研究发现，山豆根氯仿提取物对鼻咽癌细胞具有显著的抑制作用[5]。基于此，本研究以山豆根为研究对象，利用网络药理学方法、分子对接技术及细胞增殖活性实验，筛选山豆根抗鼻咽癌的活性成分，以期为抗鼻咽癌新药开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有MCV-170AICL-PC 型二氧化碳培养箱（日本Panasonic 公司）、BSC-1100-L ⅡA2 型生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、Ⅸ71 型显微镜（日本Olympus 公司）、XSE105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、FlexA-200 型酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

槲皮素对照品（批号201008，纯度>98%）购于四川省维克奇生物科技有限公司;高丽槐素、染料木素对照品（批号分别为RFS-M03003005008、RFS-R00111812016，纯度均大于98%）购于成都瑞芬思生物科技有限公司;山豆根素对照品（批号21S059-A2，纯度95.8%）购于上海甄准生物科技有限公司;越南槐醇单体（纯度>98%）为实验室自制;注射用顺铂（批号H20023460）购于齐鲁制药有限公司;RPMI-1640 培养基购于美国Hyclone公司;青霉素-链霉素溶液购于上海碧云天生物技术有限公司;其余试剂为实验室常用规格，水为超纯水。

1.3 细胞

人鼻咽癌细胞株CNE-1 购于北纳创联生物科技有限公司（批号20210426）。

2 方法与结果

2.1 山豆根抗鼻咽癌潜在活性成分的筛选

检索文献[6-12]，选择山豆根的主要化学成分（见表1），然后在PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到上述主要化学成分对应的SMILES号，再将SMILES 号导入Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中进行靶点的预测。借助GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）以“nasopharynx carcinoma（鼻咽癌）”为关键词获取与鼻咽癌相关的靶点。将上述化学成分的靶点与鼻咽癌相关靶点取交集，得到山豆根抗鼻咽癌的作用靶点及化学成分，再将两者导入Cytoscape 3.6.1 软件中，構建山豆根抗鼻咽癌化学成分-靶点网络图。将山豆根抗鼻咽癌的作用靶点输入String 数据库（https：//string-db.org/）中构建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，再借助Cytoscape 3.6.1 软件对网络进行分析[13]。结果显示，从山豆根主要化学成分中共筛选到189 个靶点，鼻咽癌疾病相关靶点共1 028 个;两者取交集后发现，山豆根抗鼻咽癌的靶点共65 个。构建的山豆根抗鼻咽癌化学成分-靶点网络见图1，山豆根抗鼻咽癌的PPI 网络见图2。

对山豆根抗鼻咽癌化学成分-靶点网络分析发现，整个网络的平均Degree 值为3.5，网络中大于平均Degree值的化学成分分别为越南槐醇、槲皮素、山豆根素、苦参酮、染料木素、山豆根色烯素、高丽槐素。由此推测，这几种成分可能是山豆根抗鼻咽癌的潜在活性成分。

由图2 可知，图中Degree 值排名前10 位的靶点分别是SRC、PIK3CA、MAPK1、MAPK3、AKT1、MAPK8、MAP2K1、PTK2、EGFR、JAK3。由此推测，这些靶点可能是山豆根抗鼻咽癌的核心靶点。

2.2 山豆根抗鼻咽癌核心靶点与潜在活性成分的分子对接测试

采用半柔性对接方式，将“2.1”项下筛选的山豆根抗鼻咽癌核心靶点与潜在活性成分进行分子对接测试，并计算活性成分与核心靶点间的结合能，评估其结合活性，结果见表2（表中，1 kcal=4.184 kJ）。在PubChem数据库下载山豆根活性成分的3D结构，在PDB蛋白数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点的结构，并对活性成分进行去除水分子以及加氢处理，借助Dockthor 平台（https：//dockthor.lncc.br/v2/）进行在线分子对接，采用Pymol 软件将结合能力较好的对接结果进行可视化处理，结果见图3。

一般认为配体与受体结合的构象稳定时，发生作用的可能性越大;并且当结合能<-7.0 kcal/mol 时，两者具有较好的结合活性，且结合能越低，对接效果越好[14]。由表1 可知，山豆根核心靶点与其对应的潜在活性成分的结合能均低于-7.0 kcal/mol，表明这些成分均具有一定的抗鼻咽癌活性。

2.3 山豆根潜在活性成分对鼻咽癌细胞增殖活性的影响

2.3.1 细胞培养将人鼻咽癌CNE-1 细胞复苏，接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，隔夜换液，并观察细胞的生长状况，当细胞处于对数生长期时，进行细胞增殖实验。

2.3.2 细胞增殖活性的检测参考文献[15]方法，取对数生长期的细胞制成密度为2×104 mL-1的细胞悬液，接种于96 孔板中，每孔接种100 μL。实验分为顺铂组（阳性对照）、高丽槐素组、越南槐醇组、槲皮素组、山豆根素组，各组给药浓度均为100 μmol/L（根据预实验结果设置）。另设不加药物只加细胞的空白组、不加细胞和药物的调零组，每组设6 个复孔。各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养至贴壁后，加入相应药物，每孔100 μL;继续培养24、48、72 h 后，分别向每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μL，培养4 h 后，弃去上清液;每孔加入150 μL 二甲基亚砜，采用酶标仪于510 nm 波长处检测各孔吸光度值（A），并计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=[1-（A 实验组-A 调零组）/（A 空白组-A 调零组）]×100%。

结果显示，给药24 h 时，顺铂、越南槐醇及山豆根素对人鼻咽癌CNE-1 细胞的抑制效果较好，细胞增殖抑制率均大于80%，而高丽槐素、槲皮素的抑制作用相对较弱。给药48、72 h 时，山豆根各活性成分的抑制作用均有所提高，且抑制作用由大到小依次为越南槐醇>山豆根素>高丽槐素>槲皮素。结果见表3。

3 讨论

鼻咽癌的新发病例大部分来自東亚和东南亚地区，其中我国新发鼻咽癌病例占全世界的47.7%，主要分布在广东、广西、湖南、福建等省份[16]。山豆根主产于广西、广东、四川、贵州等地[17]，对鼻咽癌具有一定的抑制作用，因此，筛选山豆根抗鼻咽癌的活性成分具有重要意义。

本研究利用网络药理学方法、分子对接技术，筛选出山豆根抗鼻咽癌的活性成分有越南槐醇、槲皮素、山豆根素、苦参酮、山豆根色烯素、染料木素、高丽槐素等;进一步考察其中结合能较低的越南槐醇、山豆根素、槲皮素、高丽槐素对人鼻咽癌CNE-1 细胞的增殖抑制作用，结果显示，越南槐醇、山豆根素的体外抑制作用较强，接近阳性对照药顺铂。

黄乐等[6]采用一测多评法对广西7 个产地的山豆根成分含量进行测定，结果发现，山豆根中越南槐醇含量为0.08%～0.29%;韩国研究者制备了山豆根提取物，并测得其中三叶豆紫檀苷含量为4.76%、山豆根素含量为3.17%、高丽槐素含量为1.84%[7];He等[8]对来自广西、广东、贵州、湖南、四川的17 批山豆根的黄酮类成分进行含量测定，结果显示，山豆根中槲皮素含量为0.02%～0.06%。由此可知，本研究预测的几种潜在活性成分除槲皮素外，均在山豆根中含量较高。越南槐醇、山豆根素、高丽槐素在山豆根抗鼻咽癌化学成分-靶点网络中的Degree 值均大于3.5，且与核心靶点的结合能较低;进一步细胞实验结果也表明，这3 种成分对人鼻咽癌CNE-1 细胞具有较好的抑制作用。由此推测，越南槐醇、山豆根素、高丽槐素可能是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。槲皮素在山豆根中含量较低，且对人鼻咽癌CNE-1 细胞的抑制较弱，可能不是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。2-（2，4-二羟基苯基）-5，6-亚甲二氧基苯并呋喃在山豆根抗鼻咽癌化学成分-靶点网络中仅关联4 个靶点，而且与核心靶点无关联，也可能不是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。三叶豆紫檀苷在山豆根中含量较高，且有研究报道，三叶豆紫檀苷可在大鼠体内代谢为高丽槐素[18]，由此推测，三叶豆紫檀苷可能在体内转化为高丽槐素，进而发挥抗鼻咽癌作用。

综上所述，本研究初步确定越南槐醇、山豆根素、高丽槐素为山豆根抗鼻咽癌的主要药效物质基础，可为治疗鼻咽癌的新药开发提供参考。