蒙药三子散醇提物化学成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析与鉴定

李君 胡玉霞 张梦迪 王跃武 张谦 胡格吉胡 高峰 常福厚

关键词蒙药;三子散;高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱;成分组成;结构鉴定

三子散系蒙古族经典名方，收载于2020 年版《中国药典》（一部），由诃子、川楝子、栀子3 味药材按1 ∶1 ∶1 配比组成[1]。该方具有清血热、解毒等功效，将其制成糊状外用还具有收敛、止痛、消炎的作用，蒙医临床用于温热、血热、眩晕、新久热等疾病的治疗[2]。现有研究表明，三子散所含化学成分主要包括环烯醚萜苷类、鞣质类、黄酮类、有机酸类等[3]，但其在疾病治疗过程中发挥药效的活性成分尚不清楚。而明确该方的化学物质组成是阐明其药效物质基础的重要前提。本课题组前期采用高效液相色谱串联三重四极杆质谱技术，以方中没食子酸、阿魏酸、栀子苷、槲皮素、川楝素等10 种成分含量为指标，通过正交实验对三子散的醇提工艺进行了优化[4]，并在最优提取工艺的支撑下，通过冷冻干燥技术获得了三子散醇提物。在此基础上，本研究采用具有分析周期短、检测灵敏度高等特点的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-Q-Exactive-MS）技术对三子散醇提物中的复杂化学成分进行快速在线分离与鉴定，从而为后续该方移行入血成分分析、药动学-药效学相关性研究等提供基础，进而阐明该方的药效物质基础。

1 材料

1.1 主要仪器

HPLC-Q-Exactive 型高效液相色谱-质谱联用系统（含Ultimate 3000 型色谱仪、Q-Exactive 型高分辨质谱仪）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;AP135W型十万分之一电子天平购自日本Shimadzu公司;KH-500DV型数控超声波清洗器购自昆山禾创超声有限公司;2TB-A 型磁力加热搅拌电热套购自山东鄄城华鲁电热仪器有限公司;RE3000A型全自动旋转蒸发仪购自郑州科达机械仪器设备有限公司;FDU2110 型冷冻干燥机购自东京理化器械株式会社。

1.2 主要药品与试剂

栀子（批号19072703，产地为江西）、川楝子（批号200101131，产地为四川）、诃子（批号20022403，产地为云南）饮片均购自内蒙古北域药业有限责任公司，经内蒙古医科大学药学院中药资源教研室渠弼教授鉴定分别为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis、楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc.和绒毛诃子Terminaliachebula Retz. var tomentella Kurt. 的干燥成熟果实。川楝素（批号111824-201804，纯度≥96.9%）、栀子苷（批号110749-201718，纯度≥97.6%）、山柰酚（批号110861-202013，纯度≥98.0%）、没食子酸（批号110831-201605，纯度≥98.8%）、鞣花酸（批号111959-201903，纯度≥88.8%）、槲皮素（批号100081-201810，纯度≥99.1%）、阿魏酸（批号110773-201914，纯度≥99.0%）、芦丁（批号21020402，纯度≥98.0%）、绿原酸（批号110753-202018，纯度≥96.1%）9 种对照品均购自中国食品药品检定研究院;柯里拉京（批号DST190113-012，纯度≥98.2%）、木犀草素（批号DSTDM003201，纯度≥98.0%）、齐墩果酸（批号DSTDQ005101，纯度≥98.0%）3 种对照品均购自成都德思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸、乙酸铵均为分析纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱-质谱条件

采用Shim-pack GIST-HP C18 色谱柱（150 mm×4.6mm，3 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，10%A;10～15 min，10%A→30%A;15～25 min，30%A→70%A;25～30 min，70%A→90%A;30～35 min，90%A;35～40 min，10%A）;流速为1 mL/min;柱温为40 ℃;进样量为10 μL。

采用电喷雾离子源（ESI），在正、负离子检测模式下检测。正离子检测模式下的检测条件为：辅助气体积流量30 L/min，喷雾电压3.50 kV，离子传输管温度300 ℃，辅助气温度200 ℃，碰撞能量45 eV;负离子检测模式下的检测条件为：辅助气体积流量30 L/min，喷雾电压2.80 kV，离子传输管温度400 ℃，辅助气温度100 ℃，碰撞能量30 eV。检测方式为Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500，扫描范围为m/z110～1 200。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备根据前期实验基础[4]，按处方比例称取川楝子、栀子、诃子饮片，粉碎，混匀，过60 目筛。称取混合粉末共约180.00 g，置于圆底烧瓶中，加50%乙醇1 800 mL，用电热套加热回流提取3 次、每次1.5 h，分别过滤并收集滤液。合并3 次滤液，旋蒸浓缩，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥，得到三子散醇提物冻干粉。称取上述冻干粉1.0 g 于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度后稱质量，超声（功率200 W，频率50 kHz）20 min，冷却至室温，再次称定其质量，以甲醇补足减少的质量，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取川楝素、栀子苷、齐墩果酸、山柰酚、没食子酸、鞣花酸、柯里拉京、槲皮素、阿魏酸、芦丁、木犀草素、绿原酸12 种对照品各适量，分别置于不同10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成上述12 种成分质量浓度分别为475、201、258、285、206、200、239、237、255、228、292、344 μg/mL的单一对照品贮备液。分别精密量取上述各单一对照品贮备液适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成上述12 种成分质量浓度分别为950、402、516、570、412、400、478、474、510、456、584、688 ng/mL 的混合对照品溶液，将其置于4 ℃保存，备用。

2.3 数据库的建立及分析

利用中国知网、万方等数据库检索有关三子散全方及各单味药材化学成分研究的文献，将收集的化学成分信息进行汇总，建立一个包括化合物名称、分子式、精确分子量、一级和多级质谱碎片等信息的本地数据库，从而为化合物的鉴定提供参考。将供试品溶液和对照品溶液在正、负离子模式下检测到的质谱信息导入Xcalibur3.0 软件进行数据处理，利用HPLC-Q-Exactive-MS高分辨质谱计算化合物的精确分子量，再结合保留时间、质谱信息及Xcalibur 3.0 软件拟合的分子式，通过与已建立数据库中化合物信息和部分对照品质谱数据进行比对，以实际测得与理论的偏差小于10 ppm 为原则[5]，快速鉴别出三子散醇提物中所含有的固有化学成分。

3 结果

3.1 三子散醇提物的总离子流图及成分分析

按“2.1”项下色谱-质谱条件，对三子散醇提物进行HPLC-Q-Exactive-MS 检测分析，获得了三子散醇提物在正、负离子检测模式下的总离子流图（见图1）。根据“2.3”项下分析方法，最终鉴定出化合物64 个，包括9 个黄酮类成分、13 个环烯醚萜类成分、14 个有机酸类成分、18 个鞣质类成分、3 个三萜类成分、3 个氨基酸类成分和4 个脂肪酸类成分。其中，有11 个成分的结构通过与对照品比对得到了确证。三子散醇提物化学成分的HPLC-Q-Exactive-MS鉴定结果见表1。

3.2 成分鉴定过程分析

鉴于同类成分具有相似的裂解规律，本文选取组方中主要含有的环烯醚萜类成分、黄酮类成分、有机酸类成分和鞣质类成分为例进行成分鉴定过程分析。

3.2.1 环烯醚萜类成分在组方中共鉴定出环烯醚萜类化合物13 个。本研究以栀子苷（化合物33）为例来说明环烯醚萜类成分的结构鉴定过程：在负离子检测模式下可见m/z 433.133 82[M+COOH]-的准分子离子峰，准分子离子峰相继脱去1 分子甲酸和1 分子中性碎片葡萄糖残基后产生碎片离子峰m/z 225.077 03[M-HGlu]-，然后进一步丢失1 分子H2O得到碎片离子峰m/z207.065 87[M-H-Glu-H2O]-，随后苷元进一步发生逆狄尔斯-阿德尔反应产生碎片离子峰m/z 123.043 95。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片离子峰信息及与对照品比对结果[5，7]，确认化合物33 为栀子苷。栀子苷对照品和化合物33 的二级质谱（MS2）图分别见图2、图3，栀子苷可能的裂解途径见图4。

3.2.2 黄酮类成分在组方中共鉴定出黄酮类化合物9个。本研究以芦丁（化合物39）为例来说明黄酮类成分的结构鉴定过程：在负离子检测模式下可见m/z609.147 22[M-H]-的准分子离子峰，并发现其主要二级碎片离子峰为m/z 301.034 76、m/z 300.027 80、m/z271.025 27、m/z 151.002 62，即准分子离子峰通过碰撞解离丢失芸香糖产生碎片离子峰m/z 301.034 76[M-HC12H20O9]-，并进一步脱去1 个氢产生碎片离子峰m/z300.027 80[M-H-C12H20O9-H]-，或脱去1 个中性碎片H2CO 产生碎片离子峰m/z 271.025 27[M - H -C12H20O9-H2CO]-，或发生逆狄尔斯-阿德尔反应产生碎片离子峰m/z 151.002 62。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片离子峰信息及与对照品比对结果，确认化合物39 为芦丁[11]。芦丁对照品和化合物39 的MS2图分别见图5、图6，芦丁可能的裂解途径见图7。

3.2.3 有机酸类成分在组方中共鉴定出有机酸类化合物14 个。本研究以绿原酸（化合物28）为例来说明有机酸类化合物的结构鉴定过程：在负离子检测模式下可见m/z 353.087 74[M-H]-的准分子离子峰，其特征裂解途径为结构中酯键断裂产生奎宁酸（quinic acid，QA）及咖啡酸（caffeic acid，CA），主要二级碎片离子峰为m/z191.055 54[QA - H] - 、m/z 179.034 23[CA - H] - 、m/z173.044 75[QA-H-H2O]-、m/z 135.044 10[CA-HCO2]-，即准分子离子峰脱去咖啡酰氧基或奎尼酸基团产生m/z 191.055 54[QA-H]-或m/z 179.034 23[CAH]-的特征碎片离子峰，然后进一步丢失1 分子CO2或1 分子H2O 产生m/z 173.044 75[QA-H-H2O] - 、m/z135.044 10[CA-H-CO2]-的碎片离子峰。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与对照品的比对结果，确认化合物28 为绿原酸[9-10]。绿原酸对照品和化合物28 的MS2图分别见图8、图9，绿原酸可能的裂解途径见图10。

3.2.4 鞣质类成分在组方中共鉴别出鞣质类化合物18 个。本研究以柯里拉京（化合物30）为例来说明鞣质类成分的结构鉴定过程：在负离子检测模式下可见m/z633.074 40[M-H]-的准分子离子峰，准分子离子峰失去1 分子没食子酰葡萄糖单元形成特征碎片离子峰m/z300.999 39[M-H-galloyl-glu]-，或失去1 分子葡萄糖单元和1 分子六羟基二苯甲酰基（HHDP）产生碎片离子峰m/z 169.013 34[M-H-glu-HHDP]-。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与对照品比对的结果，确认化合物30 为柯里拉京[11]。柯里拉京对照品和化合物30 的MS2图分别见图11、图12，柯里拉京可能的裂解途径见图13。

4 讨论

在前期预实验中，本课题组对不同流动相体系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸溶液）进行了考察。结果表明，在流动相中加入适量甲酸能够明显改变组方中成分的质谱响应值;而与甲醇比较，采用乙腈为流动相组成部分能够显著提高组方中各成分的分离度。因此，本研究采用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相体系。

由于传统复方制剂中成分较多且响应模式不尽相同，为获得全面的质谱信息，本研究采用正、负离子全扫描模式对三子散醇提物中的化学成分进行了辨识分析。结果，在三子散醇提物中共鉴定出64 个化学成分，以环烯醚萜类、黄酮类、鞣质类、有机酸类为主。现代药理学研究表明，环烯醚萜类成分栀子苷在抗炎、抗氧化、降压、调脂等方面作用显著，并具有保肝利胆的作用[17-18]。黃酮类化合物存在于多种药用植物中，具有多重生物活性：槲皮素可通过缩小心肌梗死面积、降低心肌髓过氧化物酶活力而发挥心肌保护作用[19];芦丁具有显著的抗炎活性，且该作用可能与其减少促炎细胞因子和炎症介质的产生有关[20]。鞣质类成分大多具有抗真菌及抗肿瘤活性，同时对结肠癌、肝癌和宫颈癌细胞均表现出了一定的抑制作用[11]。此外，本研究还鉴定出了多种有机酸类成分，其在心血管相关疾病方面作用广泛：苹果酸可提高琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶活性，增加腺苷三磷酸合成，进而保护心肌细胞的完整性[21];没食子酸具有较强的抗氧化活性，对异丙肾上腺素诱导的心肌梗死模型大鼠有较好的心脏保护作用[22];绿原酸对中轻度高血压患者具有降压作用，这可能与其抑制活性氧的过量产生、降低氧化应激有关[23]。在鉴定出的三萜类成分中，熊果酸和齐墩果酸可通过抑制血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移而发挥抗动脉粥样硬化作用[24]。

综上，本研究采用HPLC-Q-Exactive-MS 技术对三子散醇提物的化学成分进行了系统、快速、全面的定性研究，所鉴定出的多种化合物可能是三子散发挥药效的物质基础，但仍需进行进一步的药效学验证。