藏药小檗皮粗提物对人胃癌细胞株细胞活性及周期的影响*

刘章程 桑旦旺姆 袁瑞瑛 乔蓓★

1 西藏自治区人民医院肿瘤科 2 西藏大学医学院药学系 西藏拉萨 850000

胃癌是全球第5 位常见肿瘤，目前约3/4 的新发病例发生于亚洲，我国是胃癌重灾区，亚洲胃癌新发病例中我国新发病例超过2/5[1]。在我国，胃癌居男性癌症发病第2 位及女性第5 位，居男性癌症死亡第3位及女性第2 位[2]。有学者抽取2004～2005 年全国第3次死因回顾调查西藏自治区1 市4 县恶性肿瘤死亡资料（覆盖总人年数为388626 人）发现：胃癌是西藏前5 位恶性肿瘤死因的第一位[3]。可见胃癌是威胁全区人民健康、增加家庭和社会负担的主要恶性肿瘤，对其进行积极防治显得尤为必要与重要。

目前胃癌的标准治疗主要有手术、放疗及包括化疗、分子靶向、免疫治疗等的全身系统治疗。本区患者就诊时多为中晚期，多已无手术机会，以全身系统治疗及姑息治疗为主。当前胃癌的治疗药物种类较少，化疗、靶向及免疫药物毒副反应较重，有些种类不易获及且花费昂贵。面对藏区胃癌治疗的现状，临床治疗中迫切需要本地易获及且花费不高的新型药物出现。藏药在本地区历史悠久，许多患者愿意尝试传统药物进行治疗，且藏药在经济成本上具有显著优势,故本研究拟尝试从传统藏药中发掘抗胃癌肿瘤活性藏药，为胃癌的诊治提供新的思路和途径。

藏药小檗皮始载于《四部医典》，藏文译音“吉尔哇”、“杰星”、“给尔驯”等。产于西藏拉萨及其周边地区海拔3660～4400 米的山坡灌丛中，有研究表明墨竹工卡和工布江达县附近的小檗其活性成分小檗碱含量较高，具有较高的应用价值。《晶珠本草》记载:“小檗皮性凉、糙,能敛诸毒，干黄水”。有研究表明小檗皮中的小檗碱具有多种药理作用,包括抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、心脏保护、降血糖、调节脂质代谢以及免疫抑制等。对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、胃癌细胞BGC-803 等有一定的抑制作用。[4,5]本研究根据临床用药实践和文献调研确定以人胃癌细胞株BGC-803、BGC-823、SGC-7901 和藏药小檗皮为研究对象，通过体外药效学实验数据信息，探讨小檗皮治疗胃癌的细胞机制，为胃癌的临床治疗提供新的思路，为传统民族药的现代化研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物提取

将干燥的小檗皮进行粉碎，与70%乙醇按质量比1：10 混合后加热至微沸，回流提取2h，过滤；滤渣与70%乙醇按照相同比例继续提取2h。合并两次滤液，减压浓缩至浸膏，置于烘箱中烘干至粉末，用DMSO（二甲基亚砜）溶解小檗碱纯品得到母液。

1.2、MTT 法检测藏药小檗皮粗提取物对人胃癌细胞株活力的影响

1.2.1 实验材料

MTT（噻唑蓝）(BioFROXX,CAT.NO:3580GR005)，PBS（硫酸缓冲盐溶液）溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗碱纯品，人胃癌细胞株BGC803、BGC823、SGC7901。

1.2.2 实验方法

取对数生长期的人胃癌细胞BGC803、BGC823、SGC7901 分别接种于 96 孔板中，每孔3000 个细胞；置于孵箱培养 12～24h，使得细胞完全贴壁生长后，加入不同浓度的PBS（硫酸缓冲盐溶液）溶解的小檗皮粗提物和DMSO（二甲基亚砜）溶解的小檗碱纯品；继续培养48h 后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml），孵育4h 后，用移液器吸去孔内液体，每孔加入100μl DMSO，使结晶溶解，使用全波长酶标仪在570nm 和 630nm 波长处检测各孔的吸光度，计算生长抑制率。计算公式如下：细胞活力%=加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值×100%，根据孙氏综合法（改进寇氏法）计算半数抑制浓度（IC50）。

1.3 流式细胞术检测小檗皮粗提取物对人胃癌细胞周期阻滞的影响

1.3.1 实验材料

Propodium iodide（BioFrox,CAT.NO:1246MG010）,RNase A (Yeasen,CAT.NO:10405ES03)，PBS 溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗碱纯品，人胃癌细胞株BGC803、BGC823、SGC7901。

1.3.2 实验方法

取对数生长期的人胃癌细胞BGC803、BGC823、SGC7901 分别接种于12 孔板中，每孔1×105 个细胞；置于孵箱 24h 后，加入不同浓度的 PBS 溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗碱纯品；继续培养48h 后，用不含EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1000rpm、4℃离心5min，弃上清；用PBS 洗涤细胞一次，1500rpm，5min 离心收集，调整细胞浓度为1×106/ml,取1ml 单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入70%预冷乙醇500ul 固定2 小时至过夜，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液，用200μl PBS 重悬细胞，加20μlRNase A(10mg/ml) 溶液，37℃水浴 30min；再加入200μl PI 染色液(PI 10mg/ml,TritonX-100 0.2%)混匀，4℃避光孵育30min；上机检测，记录激发波长 488nm处红色荧光值，使用 FlowJo 软件分析细胞周期变化。

2 实验结果

2.1 MTT 法检测藏药小檗皮粗提取物对人胃癌细胞活力的影响

图2 MTT 法检测小檗皮碱纯品粗提物对胃癌细胞活力的影响

MTT法结果：图1、2显示，人胃癌细胞BGC803,BGC823,SGC7901对小檗皮粗提物的IC50分别为1.4mg/ml,2.8mg/ml,1.3mg/ml;对小檗碱纯品的 IC 50 分别为39.63μM,48.01μM,96.15μM。由图可见小檗皮粗提物及小檗碱纯品（阳性对照）对人胃癌细胞株的细胞活力抑制作用均随着药物浓度增加。

图1 MTT 法检测小檗皮粗提物对胃癌细胞活力的影响

2.2 流式细胞术检测藏药小檗皮粗提物对人胃癌细胞周期阻滞的影响

2.2.1 流式细胞术检测小檗皮粗提物结果

图3 显示小檗皮粗提物可以使 BGC803 细胞发生S 期阻滞；图4 显示小檗皮粗提物的对BGC823 细胞周期无明显影响；图5 显示小檗皮粗提物可以使SGC7901 细胞发生G2 期阻滞。

图3 PI 单染检测小檗皮粗提物对BGC803 细胞的周期作用

图4 PI 单染检测小檗皮粗提物对BGC823 细胞的周期作用

图5 PI 单染检测小檗皮粗提物对SGC7901 细胞的周期作用

2.2.2 流式细胞术检测小檗碱纯品（阳性对照）结果

图6 显示小檗碱纯品10μM、20μM、40μM 剂量均可以使BGC803 细胞发生S 期阻滞；图7 显示小檗碱纯品12μM、24μM、48μM 剂量均可以使BGC823 细胞发生G2 期阻滞；图8 显示小檗碱纯品24μM、48μM、96μM 剂量均可以使SGC7901 细胞发生S 期阻滞。

3 结论

图6.PI 单染检测小檗碱纯品对BGC803 细胞的周期作用

图7.PI 单染检测小檗碱纯品对 BGC823 细胞的周期作用

图8.PI 单染检测小檗碱纯品对SGC7901 细胞的周期作用

多个研究表明小檗碱有确定的抗肿瘤作用。在胃癌MGC 803 细胞中，小檗碱可影响MAPK 信号通路，抑制MGC 803 细胞增殖，并且其抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性[6]。小檗碱与d-柠檬烯1 ∶4 配伍使用时，能通过诱导MGC 803 细胞内活性氧的生成、细胞周期阻滞作用和线粒体介导的内在途径所诱导的细胞凋亡来达到协同抗肿瘤作用[7]。小檗碱可调节多个参与细胞凋亡的信号通路，降低乳腺癌MDA-MB-231细胞存活率，最终诱导细胞凋亡[8]。在人乳腺癌细胞MCF-7 裸鼠移植瘤模型中，小檗碱也表现出较好的抑制肿瘤生长的作用，而且这种抑制作用呈浓度依赖性[9]。此外，小檗碱还能够协同柔红霉素治疗白血病，加强紫杉醇抗胃肠道肿瘤的作用[10]。小檗碱为藏药小檗皮粗提物中主要成分之一。本试验结果也证实：参照阳性对照药物小檗碱纯品，藏药小檗皮粗提物可以抑制实验人胃癌细胞株BGC803、BGC823、SGC7901 细胞的活力，且随着药物浓度增加，抑制细胞活性程度越明显。同时可以诱导本实验相关人胃癌细胞株细胞发生S期阻滞及G2 期阻滞。本研究对象藏药小檗皮粗提物具有潜在抗胃癌细胞活性及抑制胃癌细胞周期作用，为拓宽传统民族药物的临床应用提供了初步的思路和理论依据。同时，因本为初步探索性实验，小檗皮粗提物的确切化学成分及其具体含量还需进一步提纯分析，主要化学成分的具体抗肿瘤机制还需进一步实验验证。细胞、动物水平进行的实验不能完全代表临床疗效，这些作用能否真正应用于临床治疗还需进一步临床研究。临床应用剂量、毒副作用及安全性也需要更多的循证医学研究验证。