基于网络药理学和生物信息学研究黄芪与黄蜀葵花配伍治疗糖尿病肾病的作用机制

吴波 喻志阳 王玥坤 张伶俐 陈醒 魏玮 高茗 蓝晓红

糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病常见的微血管并发症，据相关资料统计，我国DKD患病率在糖尿病患者中占30%～50%，且呈逐渐上升趋势，成为终末期肾病的首位病因[1]。西医学认为DKD的发病机制是由于机体糖代谢异常，血糖浓度过高促使肾脏血液动力学发生改变，肾小球滤过率降低，肾小管重吸收下降，出现蛋白尿、血尿、水肿等症状[2]。针对DKD的治疗，糖尿病肾脏病防治指南及专家共识推荐控制血糖、血压、血脂，减少尿蛋白为主，还包含生活方式干预、治疗肾功能不全的并发症以及透析治疗等。降血糖药物常用二甲双胍，但因肾功能不全导致二甲双胍无法排泄，易造成乳酸堆积，严重者可能发生乳酸性中毒；ARB/ACEI用于高血压伴大量蛋白尿优于其他降压药物，但容易造成高血钾，严重者甚至出现心律失常，对伴有慢性心功能不全患者造成严重危害。中医药是我国文化瑰宝之一，其控制DKD的发展疗效确切，因而不少学者提出将中医与西医结合诊治DKD[3，4]。有研究显示[5]，黄芪与黄蜀葵花配伍后，能显著降低患者尿蛋白水平，延缓DKD的发展，但其作用机制及主要活性成分尚不清楚。作者借助网络药理学与生物信息学的方法，探究黄芪与黄蜀葵花配伍治疗DKD活性成分、重要靶点及潜在信号通路，为临床应用和深入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 常用数据库及软件 本研究用到的数据库有：TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp search.php），String（https://cn.string-db.org/），David（https://david.ncifcrf.gov/），UniProt（https://www.uniprot.org/），Gene Cards（https://www.genecards.org/），GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）。用到的软件有：RStudio，R3.5，Cytoscape3.7，AutoDock4.6，SangBox，PyMol，OpenBabel。

1.2 黄芪、黄蜀葵花的活性成分及靶点 检索中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）获得黄芪、黄蜀葵花的化学成分，设置筛选条件为口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。检索活性成分作用的靶点信息，并在UniProt数据库中转换成靶点。

1.3 DKD相关靶点及差异基因的筛选 在Gene Cards数据库中搜索“diabetic kidney disease”，获得与DKD相关的靶点信息。在GEO数据库中，搜索与DKD相关的芯片，并用GEO2R在线分析工具分析芯片数据，得到关于DKD的表达基因。设置P＜0.05，log|FC|≥1为筛选条件，获得DKD差异表达基因。

1.4 “黄芪—黄蜀葵花—DKD—活性成分—靶点”网络的构建 将上述得到的活性成分及其对应的靶点导入到Cytoscap3.7软件，构建“黄芪—黄蜀葵花—DKD—活性成分—靶点”网络。将活性成分对应的靶点与GeneCards和GEO获取的靶点放在一起，取交集，得到共同靶点，随后构建共同靶点与其对应的活性成分网络。

1.5 共同靶点PPI网络的构建及关键基因的筛选 将共同靶点上传到String数据库，选择物种为人，选择综合得分（Combined score）＞0.4的连结关系，得到共同靶点的PPI网络图。将String平台得到的结果导入Cytoscape3.7软件，利用“Cytohubba”和“MCODE”插件对PPI网络进行分析，筛选关键靶点。

1.6 关键靶点的GO分析和KEGG信号通路富集分析 在David数据库中检索关键靶点，设置物种为人，基因表型为Office Gene Symbol，得到关键靶点的GO和KEGG富集通路。

1.7 关键靶点与活性成分的分子对接 用PyMol软件将关键靶点（蛋白）去水分子和配体，用AutoDock进行加氢，计算电荷，设置原子属性，保存为pdbqt格式。在PubChem平台上获取活性成分或原配体的结构式，保存2D SDF文件，同时用OpenBable转换成mol2格式。利用AutoDock将活性成分或原配体进行加氢，计算电荷，设置相关参数，保存为pdbqt格式。设置GridBox的格子大小能包含靶点与化合物（原配体），运算模式选择马克算法，保存为dpf格式。设置靶点为刚性分子，化合物（原配体）为对接分子，对接方法默认，保存为gpf格式。最后查看dlg格式文件，打开靶点，进行rank energy，获得分子对接结果为pdbqt格式，用OpenBable转换成pdb格式，用PyMol查看对接。

2 结果

2.1 黄芪、黄蜀葵花活性成分 检索TCMSP数据库，设置口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为筛选条件，一共获得22个活性成分，黄芪有18个，黄蜀葵花有5个，其中槲皮素存在于两味药中。见表1。

表1 黄芪和黄蜀葵花活性成分

2.2 差异表达基因的火山图和热图 利用GEO2R在线分析平台对GSE30529芯片两组数据（DKD组、空白对照组）进行分析，得到的结果用R语言中的“volcano”函数进行火山图绘制，所得结果见图1A。将TCMSP、GeneCards和GEO数据库得到的靶点取交集，获得共同靶点，见图1B；利用R语言“heatmap”函数对共同靶点进行聚类分析，得到共同靶点的热图，见图1C。火山图显示样本里的全部基因，红色表示上调，绿色表示下调，黑色表示差异不显著；热图表示的是共同靶点基因在每个样本里的表达情况。

图1A GSE30529芯片火山图

图1B 共同靶点韦恩图

图1C 共同靶点热图

2.3 构建黄芪、黄蜀葵花和糖尿病肾病的“活性成分—靶点网络” 借助Cytoscape3.7分别构建黄芪、黄蜀葵花的“活性成分—靶点”及“活性成分—DKD—共同靶点”网络。“活性成分—靶点”包含227个节点，494条边，利用“Network Analyzer”插件对网络进行分析，得到该网络的拓扑参数，活性成分中槲皮素（MOL000098）和山奈酚（MOL000422）在网络中的Degree排名最前，提示槲皮素和山奈酚可能是黄芪、黄蜀葵花主要的活性物质（见图2A）。随后将化合物对应的共同靶点挑选出来，用Cytoscape3.7构建“活性成分—DKD—共同靶点”网络（见图2B），图中包含25个节点，47条边。

图2A 活性成分—靶点网络

图2B 活性成分—DKD—共同靶点网络

2.4 PPI网络构建与分析 将上述得到的共同靶点导入String数据库，获得共同靶点的蛋白互作PPI网络（见图3A），为了便于挖掘核心靶点，则将String数据的结果保存为csv格式，并借助Cytoscape3.7软件构建PPI网络，为了排除计算结果的差错，选取了“Cytohubba”和“MCODE”两种算法进行分析（见图3B、3C），关键靶点涉及EGF、CASP3、CCL2、ICAM1、VCAM1、CXCL10、STAT1和SPP1。

图3A 共同靶点的PPI网络图

图3B Cytohubba算法的关键基因

图3C MCODE算法的关键基因

2.5 GO富集和KEGG通路分析 采用David数据库对PPI网络中19个靶标蛋白对应的基因进行GO与KEGG通路富集分析，GO富集包含生物过程（Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）。生物过程涉及细胞对环状化合物的反应、对缺氧反应、对脂多糖反应、细胞粘附、负责转录正调控、血管生成负调控和对细胞外渗的正调控等；细胞成分涉及细胞外间隙、膜筏、质膜外侧、细胞质核周区和核质等；分子功能涉及修复绑定、转录因子结合、雄激素受体结合和相同蛋白结合等。选取P值排名前20的条目，用R语言绘制GO条目气泡图（见图4A）。

KEGG富集到25条信号通路（P＜0.05），主要包括：肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、癌症通路、膀胱癌通路、Erb B通路、MAPK信号通路和Toll样信号通路等（见图4B）。

图4A GO条目气泡图（前20）

图4B KEGG信号通路气泡图（前20）

2.6 分子对接验证 上述分析结果显示槲皮素和山奈酚在黄芪、黄蜀葵花组方中起到主要作用，在PubChem数据中查询两种成分，与关键靶点进行分子对接（选取得分排在前四靶点蛋白），与原配体进行比较，活性成分与1CAM1和EGF靶点对应的蛋白结合更加紧密。槲皮素、山奈酚与关键靶点对接结果可视化展示见表2、图5。

表2 槲皮素、山奈酚与关键靶点分子对接（kcal/mol）

图5 槲皮素、山奈酚与1CAM1和EGF蛋白分子对接图

3 讨论

中药既可减少DKD患者尿蛋白，又可降低血糖、血肌酐、改善脂质代谢，一定程度上延缓DKD的发生、发展[6，7]，被广泛运用于慢性肾脏病防治[8]。黄芪、黄蜀葵花不仅可以与其他中药配伍使用，也可以作为单味药使用[9,10]。黄芪作为传统补气中药，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿等功效，现代药理研究发现黄芪具有降血糖、抗病毒、抗氧化、清除自由基和调节免疫等多方面药理作用[11]。何丽珍[12]将黄芪用于糖尿病肾病的辅助治疗，将实验组（黄芪结合西医治疗）与对照组（常规西医治疗）进行比较，实验组的尿蛋白、空腹血糖和血尿素氮显著降低。路亮[13]通过对比治疗组（黄芪汤联合常规治疗）与对照组（常规治疗），发现治疗组的24h尿蛋白定量、尿白蛋白/尿肌酐（UACRR）及血清炎症递质低于对照组。黄蜀葵花具有清热利湿、解毒排浊的功效，现代药理研究发现其具有减轻DKD炎症反应、抑制纤维化细胞因子表达、改善微循环以及保护肾小管上皮细胞等功效，广泛运用于DKD治疗[14，15]。本研究结合网络药理学和生物信息学，分析预测黄芪、黄蜀葵花配伍治疗DKD的潜在药理机制，发现两味药含有22个活性成分参与调控疾病，其中与DKD相关的主要活性成分是槲皮素和山奈酚，参与调控的关键靶点有19个，这些靶点基因主要集中在肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路和癌症通路等与肾小球上皮细胞生长、凋亡密切相关通路，此外，还富集了MAPK、Toll样信号通路与炎症发生、发展密切相关，提示黄芪、黄蜀葵花配伍可能通过多成分、多靶点、多途径的方式干预DKD的发展。

既往研究表明，槲皮素具有抗纤维化、抗氧化、抗过敏、抗血栓、抗炎、抗菌、抗病毒及清除体内自由基等多方面的药理作用[16]。陈晶波[17]研究吡格列酮与黄酮类药物抑制2型糖尿病大鼠肾脏泛素蛋白酶复合体系统介导NF-κB活化时发现，槲皮素通过改善糖脂代谢、降低氧化应激、减少蛋白尿发生、抑制NF-κB p65表达等途径减轻糖尿病大鼠肾脏病理改变，延缓疾病进程。山奈酚又称山奈黄素，广泛存在于植物的根、叶和果实中，具有抗氧化、抗癌及预防心血管疾病等多种药理活性[18]。孔令希[19]研究山奈酚抗动脉粥样硬化作用机理及其药代动力学发现，不同浓度的山奈酚能显著降低家兔血清血脂水平，与模型组比较，显著下调血管炎性分子选择素（E-sel）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表达水平。

表2所示槲皮素、山奈酚与ICAM-1和EGF的结合程度高于原配体，推测两种活性成分通过调控ICAM-1和EGF靶点来延缓DKD恶化发展。细胞间黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成员，在稳定细胞间相互作用和促进白细胞、内皮细胞的迁移起着重要作用，参与细胞信号传导与活化、细胞组织生长、炎症反应及血管生成等生理病理过程。表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）是人体重要的细胞因子，参与调控表皮细胞或内皮细胞增殖、分化，促进创面修复和愈合。图1C所示DKD患者EGF表达低于正常组，提示DKD患者肾脏损伤修复下降。与此同时，ICAM-1表达高于正常组，提示DKD患者肾脏免疫反应、炎症反应高于正常组。此外，KEGG富集的主要通路是肿瘤坏死因子信号通路，该通路与DKD的发展有着密切联系[20]。

本研究将网络药理学、生物信息学结合分析黄芪、黄蜀葵花治疗DKD的作用机制，挖掘潜在的活性成分及作用靶点，并用分子对接技术验证数据的可靠性，且预测数据与相关文献报道一致，具有一定的科学指导性。现阶段，山奈酚的临床研究鲜有报道，能否用于临床仍需加大研究样本进行临床实验验证。网络药理学的筛选是根据口服利用度和类药性，其中可能忽略了其他的活性成分，随着计算机技术和生物信息技术的发展，潜在的分子机制、作用靶点会逐渐被发现。