HPV16感染与宫颈癌的相关性及对ERK1/2信号通路的影响

任燕祥

宫颈癌为临床常见的妇科恶性肿瘤，发病率和死亡率均位列我国妇科恶性肿瘤第2位，仅次于乳腺癌[1]。人乳头状瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染为目前公认的宫颈癌重要致病因素之一，HPV种类多样，已知200多种亚型，其中人乳头状瘤病毒16型（HPV16）属高危型病毒，该亚型持续性感染在宫颈癌形成及恶化过程中发挥重要作用[2]。胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）信号通路为一种与肿瘤形成关系密切的通路，在癌细胞增殖、分化、侵袭、转移等过程中扮演重要角色，其异常活化可见于乳腺癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌等[3～5]。既往研究报道[6]，HPV16感染能够激活ERK1/2信号通路，但其是否通过该通路参与宫颈癌的发生发展仍需进一步探索研究。为此，本研究探讨了HPV16感染与宫颈癌的相关性及对ERK1/2信号通路的影响，希望为宫颈癌诊治提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 一般资料 经我院医学伦理委员会批准，选取2019年5月～2021年5月我院收治的113例宫颈癌患者作为研究对象。年龄30～80岁，平均（58.82±5.63）岁；孕1～3次，平均（2.11±0.52）次；平均体质指数（22.36±2.19）kg/m2；有吸烟史22例，有饮酒史35例；淋巴结转移46例；肿瘤分化程度：高分化80例，中低分化33例。纳入标准：①经病理学检查确诊为宫颈癌[7]；②入院前未行放、化疗治疗；③无其他部位肿瘤，无精神障碍性疾病；④病历资料齐全；⑤知情同意本研究。排除标准：①心、脑、肺、肝、肾等器官功能异常者；②认知功能障碍者；③合并血液病者；④依从性差，无法配合本次研究者。

1.2 方法 收集患者腹腔镜宫颈癌根治术中切除的癌组织和癌旁2cm正常组织。比较癌组织和癌旁正常组织内HPV16感染阳性率，比较不同FIGO分期及病理特点的宫颈癌患者HPV16感染阳性率，采用免疫组化染色法和Western blotting法检测磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织内的表达情况，比较不同FIGO分期及病理特点的宫颈癌患者p-ERK1/2蛋白表达情况，分析p-ERK1/2蛋白表达水平与宫颈癌患者FIGO分期及病理特点的相关性。

1.2.1 HPV16感染阳性率检测 行PCR-DNA反向杂交实验，即取石蜡包埋的癌组织和癌旁正常组织标本，依据试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司）说明书提取HPV16-DNA，并行PCR扩增、杂交，然后洗膜、显色。阳性判读：杂交膜条上除IC位点和显色反应控制点外，仅HPV基因型位点显蓝色，其它位点不显色[8]。

1.2.2 免疫组化染色法 癌组织和癌旁正常组织切片经二甲苯（上海钰博生物科技有限公司，批号XG-R197052）脱蜡和梯度乙醇（上海西格生物科技有限公司，批号ZSG-442298）水化，然后行微波抗原修复，经3%H2O2灭活内源性酶，经山羊血清（北京伊塔生物科技有限公司，批号YT2525）封闭0.5h，然后滴加p-ERK1/2一抗（1∶200，北京泽平科技有限责任公司，批号BS65784），4℃孵育过夜，洗净切片，滴加通用型二抗（1∶2000，上海雅酶生物科技有限公司，批号PS119），37℃孵育60min，DAB试剂盒（上海钰博生物科技有限公司，批号IC-DAB1-Ra）显色，苏木精（北京伊塔生物科技有限公司，批号YT1086）复染，洗涤，脱水，透明，封固，双盲法读片。判定标准：随机选择5个视野，阳性细胞比例≤10%判定为0分，11%～25%判定为1分，26%～50%判定为2分，51%～75%判定为3分，＞75%判定为4分；染色强度：浅黄记为1分，黄色记为2分，深黄记为3分。阳性细胞比例分数×染色强度分数＞6分定义为阳性表达，反之为阴性表达[9]。

1.2.3 Western blotting法 膜蛋白提取依据试剂盒 （武汉纯度生物科技有限公司，批号CD-02199-ML）说明进行操作，BCA法及相应试剂盒（上海吉至生化科技有限公司，批号FT-D24505）测定总蛋白含量。取膜蛋白，在SDS-PAGE凝胶内被分离转至PVDF膜，用p-ERK1/2一抗（1∶400，上海圻明生物科技有限公司，批号mYF4837），β-actin一抗（1∶500，北京百奥莱博科技有限公司，批号YT672-WXO）进行杂交，然后经辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的特异性二抗（1∶2000，北京百奥莱博科技有限公司，批号WK355-FOV）孵育60min，用ECL化学发光液（上海齐源生物科技有限公司，批号QY-SH32179）检测蛋白条带，使用Image Quant350成像仪（上海美盛自动化设备有限公司）以及Image Quant TL-1软件对光密度进行分析定量。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0软件对数据进行分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料以n（%）表示，两组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织和癌旁正常组织内HPV16感染阳性率比较 宫颈癌组织内HPV16感染阳性率为84.07%（95/113），显著高于癌旁正常组织的4.42%（5/113）（χ2=145.286，P＜0.001）；不 同FIGO分期、有无淋巴结转移、不同肿瘤分化程度的宫颈癌患者HPV16感染阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同FIGO分期、有无淋巴结转移、不同肿瘤分化程度的宫颈癌患者HPV16感染阳性率比较

2.2 免疫组化染色检测p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织的表达情况 免疫组化染色结果显示，p-ERK1/2蛋白定位于胞质或胞核，呈棕黄色或黄褐色颗粒（见图1）。113例宫颈癌组织中p-ERK1/2蛋白阳性表达者89例，占78.76%，而相应的癌旁正常组织内p-ERK1/2蛋白阳性表达者9例，占7.96%，差异具有统计学意义（χ2=115.306，P＜0.001）。

图1 p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织内的表达（×400）

2.3 Western blotting检测p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织的表达 Western blotting结果显示，p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织中的表达量分别为5.58±1.22、0.92±0.36，宫颈癌组织内p-ERK1/2蛋白表达量显著高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（t=38.944，P＜0.001）见图2。

图2 Western blotting检测p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织内的表达

2.4 不同FIGO分期及病理特点的宫颈癌患者p-ERK1/2蛋白表达比较 FIGO分期ⅡA～ⅡB、有淋巴结转移、肿瘤中低分化程度、HPV16感染患者癌组织内p-ERK1/2蛋白表达量显著高于FIGO分期IA～IB、无淋巴结转移、肿瘤高分化程度、非HPV16感染患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.5 相关性分析 p-ERK1/2蛋白表达水平与宫颈癌淋巴结转移、高FIGO分期、中低分化程度、HPV16感染呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表2 不同FIGO分期及病理特点宫颈癌患者p-ERK1/2蛋白表达情况（±s）

表2 不同FIGO分期及病理特点宫颈癌患者p-ERK1/2蛋白表达情况（±s）

病理特点 n p-ERK1/2蛋白 t P FIGO分期 7.931 ＜0.001ⅠA～ⅠB 84 4.23±0.95ⅡA～ⅡB 29 6.67±1.56淋巴结转移 9.964 ＜0.001无67 4.18±0.86有46 6.78±1.62肿瘤分化程度 7.632 ＜0.001高分化 80 4.41±0.99中低分化 33 6.55±1.48 HPV16感染 8.020 ＜0.001无18 4.50±0.82有95 6.61±1.74

表3 不同病理特点和p-ERK1/2蛋白表达相关性分析

3 讨论

HPV为一种球形DNA病毒，由DNA核心和蛋白外壳组成，感染途径有性传播、医源性感染和母婴传播等，在14～59岁人群中感染率为26.8%[10]。目前已知的200多种亚型中，约有40种和生殖道疾病的发生有关，这40种HPV亚型可继续分类为低危型与高危型，低危型可引起某些良性病变如尖锐湿疣，而高危型HPV亚型，如HPV16通常和宫颈病变有关，是宫颈癌形成的关键诱因之一[11，12]。本次研究结果显示，宫颈癌组织内HPV16感染阳性率（84.07%）显著高于癌旁正常组织（4.42%），FLGOⅡA～ⅡB期、淋巴结转移、肿瘤中低分化程度患者HPV16感染阳性率显著高于FLGOⅠA～ⅠB期、无淋巴结转移、肿瘤高分化程度的患者，表明HPV16感染与宫颈癌发生和发展显著相关，这与既往研究一致[13]。然而，宫颈癌恶性转化并非HPV感染这一单方面因素所致，宫颈癌发生和发展是环境、遗传、基因、生物等多因素相互作用的结果，该过程中机体感染HPV后，抑癌基因失活、促癌基因激活、细胞内信号通路激活等一系列过程被启动，继而使细胞生物学行为发生异常变化，如异常增殖、侵袭、转移等，最终引发宫颈癌[14]。

ERK1/2通路为细胞内十分重要的信号转导通路，ERK1/2通路中相关蛋白分子表达异常会促使癌细胞增殖、侵袭，在恶性肿瘤发生和病情进展中发挥作用。研究发现[15]，ERK1/2活化后可通过干扰合成嘧啶核苷酸、构建染色质及蛋白质翻译而引起细胞大量增殖，促进细胞周期进展；还可通过干扰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）发挥抗凋亡效应，从而促进癌细胞生长、分裂及向恶性转化。本次研究采用免疫组化染色法和Western blotting法检测p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织和癌旁正常组织的表达情况，结果均显示p-ERK1/2蛋白在宫颈癌组织中呈高表达，进一步分析发现FIGO分期ⅡA～ⅡB、有淋巴结转移、肿瘤中低分化程度、HPV16感染患者癌组织内p-ERK1/2蛋白表达量显著高于FIGO分期IA～IB、无淋巴结转移、肿瘤高分化程度和无HPV16感染的患者，提示ERK1/2信号通路的激活在宫颈癌发生和病情进展过程中有促进作用，可能会促使宫颈癌浸润、侵袭及转移。此外，HPV16感染患者癌组织内p-ERK1/2蛋白表达量显著高于无HPV16感染患者，相关性分析显示p-ERK1/2蛋白表达水平与宫颈癌患者HPV16感染呈正相关，作者认为可能是HPV16介导ERK1/2通路而参与宫颈肿瘤形成及其向宫颈浸润癌转变。Silva等[16]研究显示，宫颈上皮HPV感染之后，HPV的致癌蛋白（E6、E7）能够持续表达，推动宫颈病变进展。Cheng等[17]研究发现，ERK1/2通路能够参与突变Ras基因所致的宫颈癌Hela细胞增殖。因此，宫颈癌临床治疗干预时，可考虑从清除HPV16及抑制ERK1/2通路入手，以改善宫颈癌患者预后。

综上所述，HPV16感染可能通过持续活化ERK1/2信号通路，促使宫颈癌发生和发展，然而本次研究仅为临床初步分析，处于组织学水平，有待行基础实验基于细胞学水平进一步深入探讨。